双重PCR检测肠炎沙门氏菌方法的建立

沙门氏菌是引起人类食物中毒事件的主要病原之一,其中,肠炎沙门氏菌因其可感染家禽、污染禽蛋而受到广泛关注。本试验根据沙门氏菌属特异性基因片段fimY和肠炎沙门氏菌特异性基因片段sdfI分别设计一对引物,对25株沙门氏菌和大肠杆菌进行双重PCR扩增,结果显示22株沙门氏菌均出现与理论值大小497bp相符的属特异性条带,作为对照的3株大肠杆菌则未显示该条带,并且7株肠炎沙门氏菌均出现与理论值大小293bp相符的特异性条带。另外,敏感性试验结果显示肠炎沙门氏菌50336和鸡白痢沙门氏菌SP1的模板浓度分别为18ng和15ng时仍能清晰扩增出特异性条带。上述结果表明建立的PCR方法具有快速简便、灵敏性高、特异性强等特点,为公共卫生、食品安全、畜牧兽医及出入境安检等多部门检测和监测沙门氏菌提供了前提基础和技术保障。     

单抗酶联试剂盒与PCR方法快速检测沙门氏菌的比较

本文对单抗酶联试剂盒与PCR方法快速检测沙门氏菌进行了比较。将沙门氏菌与大肠杆菌以不同比例混合后 ,分别用ELISA和PCR法检测 ,在 1∶1 0 0的比例时 ,用这 2种方法均能检测出阳性样品 ;在 1∶1 0 0 0的比例时 ,用ELISA法检测为阴性 ,而用PCR法则能检测出。检测鲜牛奶、龙虾、虾仁、熟食制品等样品 ,2种方法的符合率达 97 6 %。对冻虾仁、人粪便样品的前增菌、选择性增菌、后增菌过程进行同步检测 ,在样品的前增菌液 ,直接ELISA法检测的OD值小于 0 5 ,而PCR法扩增能出现特异条带 ,经国标方法验证为阳性 ,证实PCR法的敏感性优于直接ELISA法 ,而在选择性增菌液和M 肉汤后增菌液中 ,2种方法均能检出阳性样品。     

沙门氏菌通用PCR快速检测试剂盒的研制与应用

根据沙门氏菌fimY基因建立了用于检测沙门氏菌的通用PCR方法。对收集的A-F群标准菌株和临床分离的60株沙门氏菌分离株和11种非沙门氏菌进行PCR检测,采用2.0%琼脂糖电泳进行检测,结果所有沙门氏菌均扩增出526bp的特异性条带,而非沙门氏菌均未扩增出任何条带。通过电泳判定结果,该法可检出扩增体系中93cfu的沙门氏菌,还可检出含3cfu的样品用BP预增菌或MM增菌后的菌液。说明该方法敏感性高、特异性强。采用直接菌体加入法、热裂解、反复冻融、CTAB碱裂解法和柱式试剂盒提取法分别提取核酸模板,结果CTAB法效果最好,但操作烦琐,而直接菌体加入法和热裂解法可以达到和柱式试剂盒同样的效果,且操作简便快速、经济、效果好,值得推广应用。     

针对fimW基因沙门氏菌的特异性PCR检测

为建立沙门氏菌快速检测方法,本研究根据沙门氏菌Ⅰ型菌毛蛋白调控基因fimW设计一对引物,建立PCR检测方法,并对收集的A群～F群14个血清型40株沙门氏菌和5种12株非沙门氏菌菌株进行PCR扩增.结果显示所有沙门氏菌均扩增出与预期(477 bp)相符的特异性片段,而非沙门氏菌扩增结果均为阴性.另外,以肠炎沙门氏菌50336株DNA为模板,敏感性试验结果显示该方法可以检测出扩增体系中1pg DNA染色体和102cfu的沙门氏菌.表明本研究建立了检测沙门氏菌简洁、敏感、特异的PCR方法.     

应用PCR技术检测沙门氏菌

参照文献报道的根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因片段所设计的引物序列,合成了１对长２５ｂｐ的引物,对沙门氏菌属Ａ－Ｆ各群中共１６株沙门氏标准菌株和其他１２株非沙门氏菌标准菌株进行ＤＮＡ抽提扩增、结果沙门氏菌ＰＣＲ产物都出现４９５ｂｐ的特异性ＤＮＡ扩增带,而非沙门氏菌均未出现扩增条带,证明这对引物具有沙门氏菌属特异性。     

EMA与PCR结合检测沙门氏菌方法的研究

为了建立一种快速区分样品中沙门氏菌的死细菌与活细菌的检测方法,将叠氮溴化乙锭（EMA）与PCR技术相结合。以沙门氏茵的invA为靶基因,以沙门氏菌的纯培养细胞做模板进行扩增,并进行灵敏度、特异性、曝光时间及EMA浓度试验。结果显示,灵敏度为14CFU／mL,最佳曝光时间为2min,当EMA的浓度小于18μg／mL时．EMA对活菌靶基因的扩增没有明显的抑制,而终浓度为1μg／mL的EMA,能有效抑制lxlosCFU／mL沙门氏菌死菌的扩增。EMA—PCR能有效降低沙门氏菌检测过程中的假阳性。     

食源性沙门氏菌的PCR检测

该试验根据GenBank数据库沙门氏菌的特有基因invA(AE008832)设计扩增长度为285 bp的引物,研究PCR技术在检测冷冻肉中沙门氏菌的检测限度.在生理盐水中食源性沙门氏菌的检测限度为103 cfu/mL;在人为污染肉汤中,普通FCR的检出限为1.98×103 cfu/mL;人为污染后的样品肉汤中沙门氏菌浓度为100,101,102 cfu/mL时,分别培养7.6.6h即可检测到.     

4种鸡源致病性沙门氏菌多重PCR检测方法的建立及应用

建立一种多重PCR方法,同时检测肠炎、鼠伤寒、鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌。针对沙门氏菌属特异性invA基因、肠炎沙门氏菌特异性Sdf I序列、鼠伤寒沙门氏菌特异性STM4497基因、鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌flhB基因设计引物,对引物浓度和反应条件进行优化,并对多重PCR特异性和灵敏度进行评估。利用建立的多重PCR方法调查河北地区蛋种鸡生产链中沙门氏菌流行现状。研究建立的多重PCR方法可快速、特异性鉴别肠炎、鼠伤寒、鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌,最低检出限为100 CFU细菌和0.5 ng基因组DNA。沙门氏菌流行病学调查显示,肠炎沙门氏菌是河北地区蛋种鸡生产链中沙门氏菌主要流行血清型。成功建立鉴别肠炎、鼠伤寒、鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌的多重PCR方法,对沙门氏菌流行病学调查及临床快速诊断具有重要意义。     

沙门氏菌简便的核酸检测技术

利用聚合酶链反应技术，特异性扩增沙工菌Ｈ１基因的２６９ｂｐ片段。８株标准一菌和３株阳性菌检测结果完全相符，并对３０株分离的疑似沙门氏菌进行了检测。采用５０μｌ体系，引物为自行设计各２０６割寡聚苷酸，各１μＭ；ｄＮＴＰｓ各１００μＭ，Ｔａｑ本科Ｕ。二温段水浴扩增３５循环，条件为预变性９７℃７ｍｉｎ，变性９４℃６０ｓ，复性和延伸６０℃６０ｓ，终延伸７２℃７ｍｉｎ。     

家禽通用型沙门氏菌和3种血清型沙门氏菌PCR检测方法的优化

为了提高通用型沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和鸡白痢伤寒沙门氏菌聚合酶链式反应（PCR）检测的准确性和灵敏度,试验通过优化整个PCR程序的退火温度、引物浓度及循环数,确定通用型沙门氏菌和各血清型沙门氏菌PCR检测最佳反应条件及检出限。结果显示：通用型沙门氏菌最佳退火温度、引物浓度及循环数分别为52.4℃、0.4μM和25个循环;肠炎沙门氏菌为50.8℃、0.6μM和35个循环;基于glg C基因检测的鸡白痢伤寒沙门氏菌最佳退火温度、引物浓度及循环数分别为53.4℃、0.4μM和35个循环;而鸡白痢沙门氏菌ipaj优化后最佳退火温度、引物浓度及循环数分别为52.4℃、0.4μM和30个循环。程序优化后通用型沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸡白痢伤寒沙门氏菌检测灵敏度大大提升,分别为43·fg/μL、4.3·pg/μL·和43·fg/μL,而鸡白痢沙门氏菌的检出限未有变化,仍为430·fg/μL。通用型沙门氏菌和3种血清型沙门氏菌PCR程序经过优化后,检出限降低,灵敏度增加,对于养殖场中饲料、环境及病料中沙门氏菌的及时检出具有重要意义。     

PCR扩增invA基因特异性检测沙门氏菌

建立了扩增invA基因检测沙门氏菌的PCR方法。对收集的50个血清型123株沙门氏菌及7种27株非沙门氏菌进行PCR,2％琼脂糖电泳检查,结果所有沙门氏菌都扩增出了300bp的特异性产物,非沙门氏菌都未扩增出此目的条带。产物的特异性由slot blot杂交进一步证实。通过电泳判定结果,该法可检出扩增体系中10pg染色体DNA及10~2cfu的纽波特沙门氏菌50029。为下步克隆而设计的两个酶切点（Bam HI,Eco RI）对引物的特异性没有影响。本研究为沙门氏菌的检测提供了简洁、敏感、特异的新方法,同时为克隆invA基因做属特异性探针打下了基础。     

沙门菌PCR快速检测试剂盒的研制与应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的沙门菌检测方法，根据沙门菌fimY保守基因序列设计合成了1对引物，建立了快速检测沙门菌的PCR方法，并对反应条件进行优化，组装成快速检测试剂盒。结果显示，所有沙门菌均扩增出526bp的特异性条带，而非沙门菌均未扩增出任何条带。检测灵敏度达93CFU，还可检出含3CFU的样品用BP预增菌的菌液或用MM增菌后的菌液，而且稳定性良好，冷冻至少能保存12个月。采用直接菌体加入法、热裂解法、反复冻融法、CTAB碱裂解法和柱式试剂盒提取法分别提取核酸模板，结果CTAB法效果最好，但操作烦琐，而直接菌体加入法和热裂解法可以达到和柱式试剂盒提取法相同的效果，且操作简便、快速、经济、效果好。通过对临床样品的检测，证实该试剂盒具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点，值得推广应用。     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

根据沙门菌保守的fimY基因序列设计合成了引物和TaqMan探针，建立了快速检测沙门菌的实时荧光定量方法，并对反应条件进行了优化，组装成快速检测试剂盒。通过对临床样品的检测，该试剂盒的检测灵敏度达4.5CFU（25μL反应体系），比常规PCR高100倍，而且稳定性良好，至少可以冷冻保存9个月。结果表明，所建立的沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点，适于大量样品的检测。     

荧光PCR法检测鸡肉中沙门氏菌的研究

作者采用合成的基因探针和引物，对2株阳性标准菌株、2株野生菌株和1个无菌去离子水进行检测，结果准确可靠，整个试验过程在30 h内完成。可见，该法是一种特异、敏感、简便、快速的沙门氏菌检测方法，对快速通关将发挥积极的作用。     

动物性食品中奇异变形杆菌PCR检测方法的研究

研究制定动物源性食品中奇异变形杆菌的PCR检测方法,为日常食品卫生监测提供快速检验的依据。根据奇异变形杆菌抗亚碲酸盐基因的保守序列设计Q248F/R,确定PCR条件,利用标准菌株检验方法的特异性和敏感度。引物Q248对奇异变形杆菌检测具有良好的特异性,对人工布菌样品的检测敏感度达1.2×102cfu/100g。通过对扩增目的片段的核酸序列测定,目的片段大小为248bp。该方法用于奇异变形杆菌检测具有特异性强、敏感、快速的特点,适用于动物性食品中奇异变形杆菌检测的快速筛选检验。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同，设计和合成了等位基因特异性PCR引物，建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法，并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示，该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌，检测灵敏度达100PgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定，鉴定出33株鸡白痢沙门菌，符合率为94．3％。表明，建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

鸡痘病毒PCR检测方法的建立

根据已发表的鸡痘病毒 (fowlpox virus,FPV) 4 b核心蛋白基因的核苷酸序列设计合成了 2对引物 ,通过对影响PCR扩增因素的优化 ,2对引物在同一反应条件下 ,以抽提 FPV DNA或直接用其毒液制备的模板均能分别扩增出预期的 5 4 9、136 1bp的片段。特异性检测表明 ,2对引物对 FPV10 2株、FPV2 82 E4 (北京 )、FPV2 82 E4 (吉林 )、v FV2 82重组鸡痘疫苗毒及 FPV临床分离株均能扩增出相应特异性片段 ,而用鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、羊痘病毒、鸡胚成纤维细胞 (CEF)制备的模板分别进行 PCR扩增却成阴性。敏感性检测表明 ,2对引物 (p1 ,2 、g1 ,2 )分别能检测到 10 - 2 、10 - 3fmol的 FPV DNA和 10 0 .5、10 - 0 .5TCID50 的病毒。以上结果表明 ,本试验所建立的 FPV PCR检测法具有较高的特异性和敏感性 ,模板制作简单 ,完全可用于 FPV的检测     

沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank提供的沙门菌invA基因序列和志贺菌ipaH基因序列设计引物,建立了二重PCR方法,在同一反应体系同时检测两种致病菌核酸,经二重PCR方法扩增后,在同一泳道同时检出沙门菌284 bp和志贺菌611 bp特异性扩增条带,而普通大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、阪畸大肠埃希菌、绿脓杆菌、蜡样芽胞杆菌、马链球菌、产单核细胞李斯特菌、鹅大肠埃希菌、猪水肿病大肠埃希菌均未出现这两种条带.对PCR产物进行测序,测序结果与已发表的基因核苷酸序列比较,沙门菌同源性为93%～100%,志贺菌同源性为98%～100%.应用建立的沙门菌和志贺菌二重PCR方法对广西6个试验猴养殖场1 665份猴粪便样品进行检测,检出沙门菌阳性25份,志贺菌阳性90份,阳性检出率分别为1.5%和5.4%.表明建立的沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法特异性强、敏感性高,适用于临床粪便样品的快速检测.     

沙门氏菌快速检测方法研究进展

沙门氏菌的检验在食品检测中具有重要意义。本文详细阐明了沙门氏菌的各种快速检测方法的原理 ,综述了其在食品沙门氏菌检测中的应用及其研究进展。免疫标记技术 ,细胞和分子生物学技术近年来以其敏感、快速、特异等特点在沙门氏菌快速检测中得到了广泛应用 ,尤其是 EL ISA和 PCR技术的应用已由实验室走向实际临床检测中。此外 ,本文还介绍了国外新近的几种沙门氏菌检测方法 ,展望了今后沙门氏菌检测方法的发展方向及实际应用前景