△^6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及其共转化表达载体的构建

采用RT—PCR的方法从海南玻璃苣中克隆了△^6-脂肪酸脱氢酶基因(△^6-dsa)。DNA序列测定结果表明，△^6-dsa全长1347bp编码448个氨基酸。△^6-dsa序列在genbank中采用BLAST程序进行同源序列分析，结果表明，△^6-dsa核苷酸序列与克隆自美国德克萨斯州的玻璃苣△^6-脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列完全相同。△^6-dsa克隆进T—easy Vector后形成质粒pG△^6-DSA。把质粒pG△^6-DSA上的△^6-脂肪酸脱氢酶基因片段克隆进含有T—DNA和35S启动子的质粒pGIN22中，形成含有目的基因的表达载体pGIN23。把表达载体pGIN23与另一个含有T—DNA、启动子、筛选标记基因的表达载体pLPN28进行亚克隆，使得筛选标记基因和△^6-dsa分别插入到同一质粒的2个相互独立的T—DNA内，构建成共转化表达载体pLIN61。     

利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因大豆

利用PCR和Southern杂交检测了161株转△^6-脂肪酸脱氢酶基因（D6D）的T1代植株,初步筛选出只含有功能基因（D6D）而不含有筛选标记基因（bar）的转基因大豆植株9株,为获得富含γ-亚麻酸但不含选择标记基因的转基因大豆奠定了基础,并为转基因大豆的安全性种植提供了保障。同时对无标记基因的转基因植株进行了叶片涂抹除草剂验证,探讨了叶片涂抹除草剂结合目的基因PCR检测筛选无选择标记转基因植株的可行性。     

Δ6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及其共转化表达载体的构建

采用RT-PCR的方法从海南玻璃苣中克隆了Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(Δ6-dsa).DNA序列测定结果表明,Δ6-dsa全长1 347bp编码448个氨基酸.Δ6-dsa序列在genbank中采用BLAST程序进行同源序列分析,结果表明,Δ6-dsa核苷酸序列与克隆自美国德克萨斯州的玻璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列完全相同.Δ6-dsa克隆进T-easy Vector后形成质粒pGΔ6-DSA.把质粒pGΔ6-DSA上的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因片段克隆进含有T-DNA和35S启动子的质粒pGIN22中,形成含有目的基因的表达载体pGIN23.把表达载体pGIN23与另一个含有T-DNA、启动子、筛选标记基因的表达载体PLPN28进行亚克隆,使得筛选标记基因和Δ6-dsa分别插入到同一质粒的2个相互独立的T-DNA内,构建成共转化表达载体pLIN61.     

A Preliminary Study on Transferring △6-Fatty Acid Desaturase Gene from Borago Officinalis into Soybean

采用RT-PCR法扩增出中国境内生长的琉璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因,序列分析表明,该基因全长为1359个核苷酸,与美国德克萨斯州的琉璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因同源性可达到99％.将克隆到的基因连接pRTL2质粒的35S启动子,构建重组载体pPTN-D6D,并通过农杆菌介导的子叶节转化系统,将该基因导人到垦农18和小粒豆2个大豆品种中.经PCR检测分析,初步证明琉璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因已导入并整合到大豆基因组中.     

向大豆导入琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的初步研究

采用RT-PCR法扩增出中国境内生长的琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因,序列分析表明,该基因全长为1 359个核苷酸,与美国德克萨斯州的琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因同源性可达到99%。将克隆到的基因连接pRTL2质粒的35S启动子,构建重组载体pPTN-D6D,并通过农杆菌介导的子叶节转化系统,将该基因导入到垦农18和小粒豆2个大豆品种中。经PCR检测分析,初步证明琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因已导入并整合到大豆基因组中。     

向大豆导入深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的初步研究

通过农杆菌介导法，将深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因导入到栽培大豆吉育43，黑农36，黑农37等品种。采用多种外植体和感染方法，从子叶节和胚轴诱导出丛生芽与再生植株，经过在含50mg/L卡那霉素的筛选培养基中连续筛选，获得一批转基因植株。经PCR检测和DNA分子杂交分子，初步证明外源基因已导入并整合到大豆基因组中。     

T5代γ-亚麻酸转基因大豆的遗传稳定性分析

利用PCR检测和标记基因抗性检测对表达γ-亚麻酸转基因大豆第5代植株的外源基因遗传稳定性及目的基因和抗性基因的分离情况进行了分析。结果表明:在20个转基因大豆株系中,有2个转基因大豆株系(TS824和TS825)只含有△6-fad基因而没有bar基因;7个转基因大豆株系(TS81、TS83、TS85、TS87、TS811、TS814、TS818)只含有bar基因而没有△6-fad基因;9个转基因大豆株系(TS88、TS89、TS810、TS813、TS815、TS816、TS817、TS819和TS820)既有△6-fad基因也有bar基因;2个转基因大豆株系(TS82和TS86)既没有△6-fad基因也没有bar基因。因此,△6-fad基因在部分株系中获得了稳定的遗传,同时有2个株系目的基因和抗性基因在后代中分离。     

农杆菌介导的花生△^12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2 RNAi抑制表达遗传转化研究

以成熟花生种子萌动4d的上胚轴为受体材料，采用农杆菌介导的转化方法，将倒位重复△^12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2片段分别与CaMV35S启动子和种子特异性表达的大豆凝集素启动子相连导入花生。经PCR检测证实含有AhFAD2倒位重复基因片段的RNAi抑制表达框架已成功转入花生。     

甘蔗转HC-Pro基因的研究

通过基因枪(PDS-1000He)轰击法将构建好的多功能蛋白HC-Pro的植物表达载体pHCFL与带PMI筛选标记基因的pZMLR14植物表达载体共转化导入易感花叶病甘蔗品种福农95-1702的胚性愈伤组织中,转化的愈伤经甘露糖筛选后获得抗性转化甘蔗幼苗。经PCR检测、氯酚红显色、RT-PCR检测和DNA点杂交分析获得转HC-Pro的转基因植株,转化率为0.8%(HC-Pro基因)、1.7%(PMI基因)和0.4%(HC-Pro基因+PMI基因)。花叶病毒接种实验结果显示,未转基因植株的发病率为75%,而转基因植株均系统性发病,推测由于HC-Pro的大量表达抑制了甘蔗体内自身的RNA沉默机制而使病情加重。其它农艺性状调查结果显示,转基因与未转基因植株之间不存在显著差异,表明转HC-Pro和PMI基因对甘蔗的生长或其他农艺性状没有负面影响。     

RNA干扰高油GmPEPc基因转入大豆研究

通过构建GmPEPc基因的植物RNAi双元表达载体,并通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法将控制油脂和蛋白合成途径的相关基因GmPEPc转入受体品种沈农9号中,通过抑制大豆内源GmPEPc基因的表达,增加油脂积累,从而获得高油的转基因大豆新品种。在大豆组织培养过程中,共切取大豆外植体407块,获得T0代转化苗35株,转化率8.9%。通过对转基因后代中目的基因的整合及表达情况进行分子鉴定。获得23株T_1代转基因后代,其中高抗草丁膦除草剂(喷施浓度300 mg·mL~(-1))14株,通过PCR检测结果表明其中12株为PCR阳性;PCR和Southern杂交检测表明,GmPEPc基因已经成功插入到转基因大豆植株基因组DNA中。对T_1代测定结果显示,转基因大豆籽粒的平均含油量比对照高9.51%,平均蛋白质含量下降5.44%。这些研究结果为筛选高油脂含量的转基因大豆新株系提供了依据,为下一步高油新品种的选育提供了种质基础。