凡纳滨对虾在微囊藻毒素(MC-LR)诱导下3种抗菌肽基因的表达量分析

蓝藻水华可产生大量藻毒素,其中以微囊藻毒素危害最大。研究表明微囊藻毒素可影响包括虾类在内的多种水生生物的生长和繁殖,亦可导致虾类免疫系统受损。本研究通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了在微囊藻毒素MC-LR作用下,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体液免疫中3种主要的抗菌肽基因(Penaeidin 3、Crustin和ALF)的表达量变化情况,发现Penaeidin 3和ALF受到MC-LR影响较大,Crustin基因表达量虽有所上调,但变化不大。同时,通过再次注射鳗弧菌(Vibrio anguillarum)对3种抗菌肽在MC-LR影响下抗菌能力的检测,发现3种抗菌肽表现出相对一致的变化,即表达量均在前期下调,4 h后逐渐上调,在MC-LR处理组中的表达量低于对照组的趋势。结果表明MC-LR可能通过直接或间接的方式影响对虾3种抗菌肽基因的表达,对免疫系统造成损伤,致使对虾抗病能力减弱;这一结果表明,长期发生铜绿微囊藻水华的虾池对虾存活率下降,可能与微囊藻毒素影响对虾抗菌肽基因的表达有关。     

微囊藻毒素对凡纳滨对虾急性毒性的研究

为探讨MC-LR对凡纳滨对虾的急性毒性研究,为凡纳滨对虾的科学养殖提供参考依据。以凡纳滨对虾为实验材料,分别注射0、50、100和200μg/kg浓度的MC-LR,记录死亡个体,计算不同浓度MC-LR注射情况下凡纳滨对虾的死亡率及LC₅₀,观察其急性毒性效应。研究结果表明,MC-LR对凡纳滨对虾24、48、72和96 h的LC₅₀分别为439.990、384.655、346.659、320.663μg/kg。凡纳滨对虾对MC-LR的耐受性较强,个体较大及遭受低浓度MC-LR感染凡纳滨对虾对MC-LR的耐受能力更强。为MC-LR对凡纳滨对虾不同个体大小影响及毒性作用机制研究具有一定意义。     

急性降温对凡纳滨对虾血液生化指标 及细胞免疫指标的影响

为了解凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)对急性降温的耐受性,运用生化分析法和流式细胞术,研究了急性降温对凡纳滨对虾8项血液生化指标及6项细胞免疫指标的影响。结果显示,当水温从30℃降至16℃时(降温速率-4℃/h),凡纳滨对虾血糖含量显著下降,其他7项生化指标包括总蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、胆固醇、甘油三酯、乳酸脱氢酶、肌酸激酶活性/含量均有不同程度的上升,其中总蛋白的上升达到显著水平。细胞免疫指标包括血细胞总数、活性氧含量、非特异性酯酶活性在降温后显著下降,细胞凋亡率显著上升,3类血细胞的组成比例则无显著变化。表明急性降温可能导致凡纳滨对虾血糖迅速消耗,蛋白质、脂肪的分解作用加强,细胞膜通透性的增加,引起组织损伤及相关代谢酶的外泄,并使细胞免疫功能受到损害;也说明凡纳滨对虾对急性降温非常敏感,会发生一系列生理功能的紊乱和免疫功能的下降。     

生物统计法分析T-2毒素对凡纳滨对虾形态指标的影响

以不同剂量T-2毒素染毒的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,以毒素染毒剂量为自变量、凡纳滨对虾形态学指标为因变量,采用灰色关联度分析、通径分析和回归分析探究毒素剂量与染毒凡纳滨对虾形态学指标的相关性,筛选出最便捷、最简单的生物学统计方法。灰色关联度和通径分析显示,凡纳滨对虾体质量、体长、头胸甲长和第一腹宽是受T-2毒素影响最大的指标;利用回归分析进行显著性检验发现,T-2毒素对凡纳滨对虾体质量、体长、头胸甲长和第一腹宽指标的影响均为显著水平(P<0.05)。3种统计学方法得出的结果相吻合,体质量、体长、头胸甲长、第一腹宽等染毒凡纳滨对虾形态指标的重要生物学标记,均与T-2毒素的暴露剂量呈负相关。其中,灰色关联度分析法是最便捷、最简单的生物统计法。     

蜈蚣藻多糖对凡纳滨对虾免疫相关基因表达的影响

[目的]研究蜈蚣藻多糖对凡纳滨对虾免疫相关基因表达的影响,为今后将蜈蚣藻多糖开发成凡纳滨对虾免疫增强剂提供理论依据.[方法]将试验凡纳滨对虾随机分为4组,其中A组（对照组）对虾投喂基础饵料,B、C、D组对虾分别喂食含有0.1％、0.2％和0.3％蜈蚣藻多糖的药饵,饲养15d后采用实时定量PCR对各组凡纳滨对虾的肝胰腺组织真核细胞翻译起始因子5A、巨噬细胞移动抑制因子、血蓝蛋白、酚氧化酶原、C凝集素、溶菌酶、热休克蛋白70等7个免疫相关基因的表达水平进行检测.[结果]投喂基础饵料和投喂蜈蚣藻多糖药饵的凡纳滨对虾在外表和行为上无明显差别,且均未出现对虾死亡现象.与A组相比,B、C、D组对虾肝胰腺组织中血蓝蛋白、酚氧化酶原、热休克蛋白70等3个基因的表达量明显升高,且均表现为D组＞C组＞B组＞A组;而真核细胞翻译起始因子5A、巨噬细胞移动抑制因子、C凝集素、溶菌酶等4个基因的表达量无明显变化.[结论]蜈蚣藻多糖可影响凡纳滨对虾的非特异性免疫功能,今后可将蜈蚣藻多糖用于对虾病害防治,以减少化学药物的使用.     

T-2 毒素对凡纳滨对虾肌肉氨基酸含量 的影响及其灰色关联分析

为了探讨对虾肌肉氨基酸含量与饲料中T-2毒素暴露剂量的相关性,利用不同剂量T-2毒素的染毒饲料喂养凡纳滨对虾,养殖20 d后检测各试验组对虾肌肉的17种氨基酸含量,并作氨基酸评分和灰色关联分析,从而获得对虾肌肉氨基酸含量的差异程度和相关程度。氨基酸评分结果显示,当T-2毒素暴露剂量≤1.2 mg/kg饲料时,对虾肌肉必需氨基酸指数升高,当T-2毒素剂量1.2 mg/kg饲料时,必需氨基酸指数则降低;灰色关联结果显示,17种氨基酸含量的变化与T-2毒素剂量均具有显著相关性,而且每种氨基酸的关联度非常接近,其中蛋氨酸与T-2毒素剂量具有最大关联。结果表明,T-2毒素对对虾肌肉氨基酸具有低剂量刺激和高剂量抑制的特点,其中蛋氨酸受抑制影响最大。     

复方中草药对凡纳滨对虾热应激蛋白70基因表达的影响

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),分别对在基础饲料中添加了1%复方中草药的试验组和只喂食基础饲料的对照组凡纳滨对虾的肝组织进行HSP70基因的mRNA表达检测,并以18S rRNA为内参照进行基因表达水平的半定量分析.结果显示,试验组凡纳滨对虾的肝组织HSP70基因的mRNA表达显著高于对照组(p<0.05),说明复方中草药可提高凡纳滨对虾HSP70基因mRNA的表达量,表明在饲料中添加复方中草药有利于凡纳滨对虾的生长和抗病、抗逆功能的增强.     

凡纳滨对虾营养需求研究

凡纳滨对虾是目前世界上养殖虾类产量最高的三大品种之一,是水产养殖中非常重要的物种.提高凡纳滨对虾的产量是水产养殖中的重要课题.综合现有关于凡纳滨对虾营养学的研究,从蛋白质、脂类、碳水化合物、微生物和矿物质几个方面出发,分析凡纳滨对虾生长的营养需求.对凡纳滨对虾营养需求的分析能够为改善和控制凡纳滨对虾的生长、提高营养物的消化利用率,从而进一步研究凡纳滨对虾生长所需的最佳营养素配比、构建营养更加均衡的饲料提供重要参考.     

凡纳滨对虾室内生态育苗技术

介绍了凡纳滨对虾室内生态育苗技术,包括设施与材料、育苗车间消毒处理、育苗用水处理、无节幼体投放、培育管理、生物饵料培养、常见疾病的防治方法等方面内容。最后,对凡纳滨对虾室内生态育苗的关键技术进行了讨论。     

凡纳滨对虾转录组测序分析及肌肉生长发育相关基因的筛选

【目的】筛选出凡纳滨对虾生长发育的功能基因及代谢调控网络,揭示其生长发育的分子机制,为后续开展凡纳滨对虾分子生物学研究提供宝贵的基因数据来源。【方法】以快速生长群体和慢速生长群体的凡纳滨对虾肌肉组织为研究材料,通过Illumina HiSeqTM2500平台对构建的cDNA文库进行高通量测序分析,以StringTie进行拼接组装后利用DESeq2筛选差异表达基因,并基于KOG、GO、nr、COG、Swiss-Pro、KEGG和Pfam等数据库进行差异表达基因功能注释分析。【结果】经拼接组装共获得53458844条Clean reads,各样品Clean reads的Q30均在93.00%以上;Illumina测序获得的Clean reads与参考基因组的比对效率在87.75%~87.80%,说明转录组测序数据真实可靠。采用SnpEff进行SNP/InDel变异注释分析,结果显示,SNP位点中以A>G、G>A、C>T和T>C等4种类型的数量较多（14950~21562个）,InDel位点则以SYNONYMOUS_CODING的数量最多（33630个）。使用StringTie对Mapped reads（比对到参考基因组的Reads）进行拼接,共发掘到4607个新基因,分别输入COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG和nr数据库中进行序列比对,最终发现共有1098个新基因被注释,以被nr数据库注释的新基因数量最多（1077个）,而被COG数据库注释的新基因数量最少（416个）。基于Q-value<0.05且Fold Change>2的筛选条件,共获得1408个差异表达基因（661个为显著上调表达基因,747个为显著下调表达基因）;1408个差异表达基因被注释到53个GO功能条目中,其中,22条被注释到生物学过程（Biological process）,16条被注释到细胞组分（Cellular component）,15条被注释到分子功能（Molecular function）;KEGG信号通路富集分析发现3条重要的信号通路,分别是溶酶体通路（Lysosome）、氨基糖和核苷酸糖新陈代谢（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism）及鞘脂类代谢（Sphingolipid metabolism）。在溶酶体通路中,CTSL基因、Nramp基因、MyoG基因和Myf5基因在凡纳滨对虾快速生长群体肌肉组织中呈上调表达,而Trypsin基因呈下调表达。【结论】通过转录组测序分析从快速生长群体和慢速生长群体的凡纳滨对虾肌肉组织中筛选出1408个差异表达基因（661个为显著上调表达基因,747个为显著下调表达基因）,主要富集在溶酶体、氨基糖和核苷酸糖新陈代谢及鞘脂类代谢等通路上,在对虾肌肉生长发育过程中发挥重要作用。     

广东省南美白对虾豚鼠气单胞菌的分离鉴定

广东省某养殖场南美白对虾于2012年突发传染病,为确定该病病原并对其进行有效防制,特利用分子生物学技术对病原进行了分离鉴定。结果从发病南美白对虾分离纯化到1株优势菌ZHBX12016,将该菌人工浸浴感染南美白对虾,5 d后南美白对虾死亡率达95%,且发病对虾临床症状与自然病例相似,人工注射感染测得其半数致死量LD50为6.43×103cfu/mL。该菌革兰氏染色阴性,短杆状;对半乳糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖产气、精氨酸双水解酶,赖氨酸脱酸酶,葡萄糖酸盐的生化反应性与豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)(synonym Aeromonas punctata)生化反应结果相同。用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增该菌16S rD NA序列进行测序和生物信息学分析,结果显示:分离菌株与豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)相似性达97.7%~100%之间,在系统发育树上聚为同一分支。综合该菌形态学、致病性、生理生化和16S rRNA基因分析结果,将其鉴定为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)。药敏试验结果表明分离菌株对氯霉素、土霉素、丁胺卡那、呋喃唑酮等高度敏感。     

中草药对凡纳滨对虾生长、血淋巴非特异性免疫和肌肉成分的影响

为探索三黄(黄芪、黄芩、大黄,简称三黄)等中草药在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)饲料中的应用效果,分别在基础饲料(对照组)中添加1.0%三黄、2.0%三黄、2.0%杜仲三黄(1%杜仲+1%三黄)、2.0%复方一(主要成分为黄芪、霪羊藿、党参、大黄、黄芩等)和2.0%复方二(主要成分为黄芪、杜仲、金银花、白术、黄芩等),饲喂平均体质量为(7.5±0.2)g的凡纳滨对虾42 d,共6个处理组,每个处理组设置4个平行。结果表明:各处理组存活率均在96.3%以上,且无显著差异(P0.05);2.0%杜仲三黄组(145.3%)、1.0%三黄组(143.8%)增重率均较对照组(124.5%)显著提高,饲料系数显著降低(P0.05);与对照组相比,各中草药添加组血淋巴非特性异免疫指标在不同程度上有所改善,其中2.0%杜仲三黄组的血淋巴ALP、PO活力显著提高(P0.05);在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的攻毒实验中,1.0%三黄组的死亡率较对照组显著降低(P0.05);2.0%杜仲三黄组肌肉胶原蛋白含量最高(0.30%),较对照组提高42.86%(P0.05)。上述结果表明,饲料中添加2.0%杜仲三黄、1.0%三黄,可提高凡纳滨对虾增重率,降低饲料系数,其中1.0%三黄可提高虾体抗溶藻弧菌感染的能力,添加2.0%杜仲三黄,可增加虾体肌肉胶原蛋白含量。     

绿原酸对凡纳滨对虾抗氧化系统及抗低盐度胁迫的影响

对绿原酸调节凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血淋巴抗氧化系统功能及抗低盐度胁迫的效果进行了评价。360尾凡纳滨对虾随机分为4组,分别投喂含有0、100、200和400 mg/kg绿原酸的饲料28 d,随后将对虾从盐度为32的天然海水直接转入至盐度为10的水中胁迫72 h。结果表明,在正常养殖条件下,绿原酸对凡纳滨对虾的成活率、血淋巴总抗氧化能力(Total antioxidative capacity, T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)及过氧化氢酶(Catalase, CAT)活力均无明显影响,然而投喂含有绿原酸的饲料14 d,对虾血淋巴谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPx)活性和血淋巴细胞GPx和CAT基因表达水平均显著高于对照组(P<0.05);低盐度胁迫24 h,绿原酸组凡纳滨对虾的存活率较对照组提高10%,但各组之间无显著性差异(P>0.05);低盐度胁迫24 h,各组凡纳滨对虾血淋巴T-AOC、SOD和GPx活性与胁迫前相比均显著增加,说明低盐度胁迫条件下机体产生了抗氧化胁迫反应,同时绿原酸组对虾血淋巴GPx、CAT活性均显著高于对照组(P<0.05);低盐度胁迫72 h,绿原酸组对虾血淋巴T-AOC、GPx和CAT活性和血淋巴细胞GPx和CAT基因表达水平均明显高于对照组。上述结果表明绿原酸可有效调节凡纳滨对虾的抗氧化系统功能,增强对虾对于低盐度胁迫下的适应能力。     

凡纳滨对虾温棚高位池养殖密度及简易水质调控措施效果研究

当前凡纳滨对虾为我国对虾海淡水养殖的重要品种,温棚高位池是其在浙江宁波地区重要的养殖方式,研究养殖密度与水质调控技术是推广该养殖方式的当务之急。通过第一茬70 d生产性养殖实验,探讨了早春温棚高位池养殖密度对水质、对虾生长与养殖效果的影响。结果表明:早春温棚高位池高密度(315、375ind/m2)养殖效果良好,单位水体产量分别为1.54 kg/m2与1.32 kg/m2。两种密度水平下,虾生长与养殖效果无显著差异(P0.05),主要水质指标也无显著性差异(P0.05),NH3-Nm(0.058~0.081 mg/L)与NO2--N(0.001~4.290 mg/L)等控制在对虾安全生长范围内。控制换水量与投饵量、启用增氧机等简易措施均可使主要水化指标不同程度改善,换水量20%使TAN与CODMn显著降低34.7%与29.9%(P0.05),增氧机启动2 h可使溶解氧增加11.8%~29.4%。300 ind/m2养殖密度在温棚高位池养殖中是可行的,通过简易水质调控措施能够较好地调控水质,这为其推广提供了可能。     

淡水养殖凡纳滨对虾IHHNV-WSSV共感染率调查分析及其对免疫相关酶活性的影响

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)均为需向OIE报告的虾类病毒,本研究于2014年对上海地区部分淡水养殖凡纳滨对虾WSSV和IHHNV的感染及共感染情况进行了跟踪、检测和人工感染分析。检测结果显示,WSSV和IHHNV平均单感染率分别为42.6%和38.5%,双病毒共感染率为20.5%,其中,IHHNV-WSSV共感染率与WSSV感染率呈正相关。病理和累计死亡率分析显示,尽管IHHNV-WSSV组的对虾累计死亡率比同一时间点WSSV组低,但是这两组濒死对虾鳃丝细胞的病变都很严重,病变程度无明显差异。免疫相关酶——超氧化物歧化酶和酸性磷酸酶活性分析表明,IHHNV-WSSV共感染可以在一定程度上比单纯WSSV感染激起更高和更快些的免疫应答,但是,随着感染时间的延长,IHHNV-WSSV共感染表现出比WSSV单感染更长时间的免疫抑制。研究表明,虽然IHHNV-WSSV共感染可在一定时间范围和一定程度内降低对虾累计死亡率,但是共感染可造成病毒致病性的叠加和宿主更长时间的免疫保护低下,因此,IHHNV-WSSV共感染导致的损失可能比单病毒感染更大。     

两种弧菌感染大黄鱼免疫相关基因的SNP位点分析

为了探究大黄鱼(Larimichthys crocea)免疫相关基因的SNP与弧菌抗性关系,分别利用鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)人工感染大黄鱼。对感染前后抗感群体的转录组进行高通量测序、筛选并分析其抗病差异:(1)筛选氨基酸的非同义突变SNP位点在抗鳗弧菌组有17个,而抗副溶血弧菌组的有28个;(2)一代测序验证结果发现,染色体NW_011323507.1上白细胞介素6受体基因(IL-6R)第91 196位碱基G突变为C,导致缬氨酸突变为亮氨酸,该位点G/C在抗鳗弧菌组、对照组样本之间突变基因型CC频率分别为12.5%和0,呈显著性差异(P0.05);(3)补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9(CTRP9)基因在染色体NW_011323975.1上的35 665位碱基突变(A-G),在副溶血弧菌抗感易感群体中突变位点基因型GG频率分别为37.5%和0,呈极显著性差异(P0.01)。结果表明,IL-6R-91196-G/C位点突变与大黄鱼抗鳗弧菌有关联,CTRP9-35665-A/G位点突变与大黄鱼抗副溶血弧菌有关联,这为大黄鱼抗弧菌群体的选育提供了理论依据。     

藻菌生物絮团中光照强度对凡纳滨对虾育苗效果的影响

为探究藻菌生物絮团系统中光照强度对于凡纳滨对虾幼体培育的影响,在实验桶上方分别设置了200 W(L200组)、100 W(L100组)和0 W(L0组)3种光照进行育苗实验,光照强度分别为(8422±195)lx、(4400±204)lx和(3±1)lx。整个养殖过程不换水,养殖14 d。结果显示:藻菌生物絮团系统能较好控制氨氮、亚硝氮等水质指标,增大光照强度能有效降低水体pH与碱度的下降幅度。L200组仔虾体长与体质量显著高于其他组(P<0.05)。高强度的光照提高了幼体存活率,降低了水体总弧菌数占比,但各组差异不显著(P>0.05)。L200组仔虾水分含量显著低于其他组(P<0.05)。光照强度对仔虾粗蛋白质与粗脂肪含量影响不明显。各组絮团营养成分无显著性差异(P>0.05)。实验表明,在藻菌共处型生物絮团系统中,施加一定光照强度可使水质更稳定,促进虾苗生长发育,对育苗生产有益。     

RNA干扰不同类型TLR基因对罗氏沼虾免疫相关基因表达的影响

本研究探讨了罗氏沼虾三种Toll样受体基因（Toll-like receptors,TLRs）的生理功能,为罗氏沼虾的免疫研究提供基础。实验通过对罗氏沼虾注射0.4μg/g、0.8μg/g和1.2μg/g（siRNA/体质量）三种剂量小干扰RNA（Short-interfering RNAs,siRNA）将MrTLR1、MrTLR2和MrTLR3三种TLR基因分别沉默。并采用荧光定量PCR技术对这三种Toll样受体基因在注射siRNA后0h、6h、12h、24h和48h鳃组织中的相对表达量进行分析,结果显示1.2μg/g组为最适干扰剂量。选取注射1.2μg/g siRNA后0h、24h以及48h鳃样品,结果显示在沉默MrTLR1后,罗氏沼虾体内髓样分化因子88基因（MyD88）、甲壳素基因（Crustin）和抗脂多糖因子基因（ALF）的相对表达量均出现显著下降,相反MrTLR2的相对表达量出现了上升;将MrTLR2沉默之后,MyD88以及Crustin的相对表达量明显下降;而在沉默MrTLR3后,免疫缺陷同系物基因（IMD）以及ALF的表达量显著上升,此外三种TLR基因的沉默对酚氧化酶原基因（proPO）的表达没有影响。研究结果表明MrTLR1和MrTLR2可调控MyD88以及抗菌肽的表达;而MrTLR3不仅参与Toll信号通路,也可能影响IMD信号通路。