病犬大肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因检测研究

摘要：为了解郑州市发病犬大肠杆菌对氨基糖苷类药物高度耐药的16S rRNA甲基化酶流行情况,本研究测定了分离自河南郑州市宠物医院发病犬的123株大肠杆菌对氨基糖苷类代表药物阿米卡星的敏感性;分别设计6种16S rRNA甲基化酶基因特异性引物,对耐药分离株进行16S rRNA甲基化酶基因PCR扩增检测。检测结果显示,在发病犬大肠杆菌中仅检测到armA和rmtB,其检出率分别为3.25%（4/123）和38.2%（47/123）。其中,有3.25%（4/123）的大肠杆菌可同时检测到armA和rmtB。这些结果提示,此地区发病犬大肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因以rmtB为主。病犬细菌一旦携带这些耐药基因,可导致对氨基糖苷类药物高度耐药,应引起重视。     

质粒介导的喹诺酮类耐药基因在鸡源大肠杆菌中的流行

为了解河南省质粒介导的喹诺酮类耐药基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac(6′)-Ib-cr)在产16S rRNA甲基化酶鸡源大肠杆菌中的流行与分布,分别设计特异性引物对2005-2008年在河南省病鸡病料中分离保存的158株16SrRNA甲基化酶阳性鸡大肠杆菌进行PCR扩增。结果显示,在158株产16S rRNA甲基化酶鸡源大肠杆菌中,qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac(6′)-Ib-cr的检出率分别为0.6%,2.5%,13.9%,2.5%和58.2%。提示质粒介导的喹诺酮类耐药基因在河南省产16S rRNA甲基化酶鸡源大肠杆菌中普遍存在,且以qnrS和aac(6′)-Ib-cr为主。     

16S rRNA与Vitek-32对临床感染猪肠球菌鉴定结果比较

【研究目的】旨在研究两种常用的细菌分型方法对感染猪的肠球菌鉴定结果进行比较。【方法】对从河南洛阳、济源、许昌、南阳等地送检病猪体内分离到42株革兰阳性球菌分离纯化后,分别用16S rRNA基因序列和Vitek-32全自动细菌鉴定系统对其进行鉴定。【结果】Vitek-32对42株分离菌中的34株鉴定到种的水平,分别是粪肠球菌(E. faecalis) 10株、屎肠球菌(E. faecium) 2株、铅黄肠球菌(E. casseliflavus) 22株;另有8株未成功鉴定。16S rRNA基因序列分析对42株分离菌成功进行了鉴定,分别为粪肠球菌12株,屎肠球菌30株。通过对两种方法鉴定结果比较发现,Vitek-32鉴定的10株粪肠球菌中除1株被16S rRNA鉴定为屎肠球菌外,其余9株均相同;Vitek-32鉴定的2株屎肠球菌与16S rRNA鉴定结果相同;Vitek-32鉴定的22株铅黄肠球菌除了1株被16S rRNA鉴定为粪肠球菌外,其余全部被鉴定为屎肠球菌;8株未被Vitek-32鉴定的肠球菌中,16S rRNA将其鉴定为2株粪肠球菌和6株屎肠球菌。【结论】在感染猪的肠球菌分型鉴定中,Vitek-32对粪肠球菌鉴定结果与16S rRNA比较具有较高的一致性（75％）;而对于屎肠球菌的鉴定结果与16S rRNA比较出现了较大的差异（93.3％）。     

鸡源性大肠杆菌产超广谱β-内酰胺酶基因型分布

摘要: 检测鸡大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的基因型并了解辽宁省鸡源性大肠杆菌产ESBLs基因型分布。对大连4个地区不同鸡场临床分离32株产ESBLs鸡大肠杆菌分别用TEM、OXA、CTX-M和SHV等4种通用引物进行PCR扩增确定其基因型。结果显示32株鸡大肠杆菌均检出TEM型基因、12株检出CTX-M型基因、2株检出OXA型、未检出SHV型;TEM+CTX-M双阳性检出11株、TEM+OXA双阳性检出2株。TEM基因亚型占检出比例最高（100％）。结论：目前辽宁省产ESBLs鸡大肠杆菌基因亚型以TEM为主,其次为CTX-M型,未发现SHV型;以TEM+CTX-M双阳性检出率最高（34.4％）。     

不同家禽产ESBLs沙门菌的流行分布与耐药分析

了解胶东地区不同家禽携带沙门菌的流行分布及其耐药现状，为有效防控家禽沙门菌的流行传播及遏制其耐药提供依据。采用细菌的常规分离培养、质谱法、PCR法和微量肉汤稀释法等，对2021年8—10月在胶东5个地区3种家禽养殖场采集的3150份泄殖腔拭子进行沙门菌分离鉴定、血清型鉴定、药敏试验及β-内酰胺酶主要耐药基因的检测，利用统计学方法进行差异显著性分析。结果发现：(1)共分离获得194株沙门菌(6.16%)。水禽源沙门菌的携带率(14.36%)比肉鸡(5.04%)、蛋鸡(1.15%)高。(2)较多的血清型为S.Enteritidis(38.14%)、S.Kentucky(21.65%)、S.Senftenberg(14.95%)、S.Indiana(12.37%)、S.Typhimurium(8.76%)为主。肉鸡和水禽(均为7种)的沙门菌血清型较蛋鸡(3种)多，但均以S.Enteritidis为主。(3)110株禽源沙门菌对氨苄西林、异磺胺异噁唑、四环素3种药物耐药相对严重(58.18%～77.27%)，未检测到美罗培南的耐药菌株。水禽和肉鸡源菌株较蛋鸡耐药严重，尤其对阿莫西林/克拉维酸(...     

石河子地区临床奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定与药敏试验

为研究新疆石河子地区某奶牛养殖场临床奶牛乳房炎的病原菌及耐药情况,对送检的15份乳样进行病原菌的分离鉴定、形态学观察、16S rRNA基因序列对比以及药物敏感性试验。结果显示,分离到1株大肠杆菌和5株金黄色葡萄球菌。菌株16S rRNA序列比对,大肠杆菌同源性大于99.9%,金黄色葡萄球菌的同源性在97.49%～99.71%之间。将两类分离菌对临床上常用的20种药物进行药物敏感性试验,结果显示金黄色葡萄球菌对17种药物敏感,对3种药作用尚不清楚;大肠杆菌对9种药物敏感,对7种药作用尚不清楚,对剩余的4种药物表现为中介。试验结果为临床治疗奶牛乳房炎的合理用药提供了理论依据。     

棉花黄萎病生防内生芽孢杆菌LH-L3的分离鉴定

【目的】获得能够防治黄萎病菌的棉花内生芽孢杆菌。【方法】将棉株组织研磨液80℃加热后,采用涂板法分离内生菌,将对大丽轮枝菌强致病力菌株Vd084拮抗效果最好的菌株,依据菌体形态、生理生化特征、16S rRNA、gyrB和rpoB基因序列分析进行鉴定,并以盆栽试验确定其对棉花黄萎病的防效。【结果】分离到61株芽孢杆菌类似菌,其中17株能拮抗大丽轮枝菌。复筛得到1株拮抗活性较高、抑菌谱较广的菌株LH-L3。该菌株被鉴定为甲基营养型芽孢杆菌。与无菌水对照相比,用106 mL~(-1)的LH-L3菌液浇灌3次的棉花出苗率、株高、根长、地上以及地下部分鲜物质质量分别提高42.85%、10.24%、23.83%、10.05%、97.62%,对棉花黄萎病的防治效果达到85.24%。【结论】菌株LH-L3有较好的促生长和棉花黄萎病防治的效果,具有进一步开发应用潜力。     

甘薯和巴西牵牛18S rRNA基因的克隆和序列分析

【研究目的】为甘薯和侵染甘薯病毒的基因表达研究提供内参基因序列信息。【方法】分别以‘商薯19’、‘北京553’两甘薯品种和巴西牵牛的基因组DNA为模板,利用PCR方法克隆甘薯和巴西牵牛18S rRNA基因序列。【结果】测序结果表明,获得的供试两甘薯品种和巴西牵牛的18S rRNA基因序列长度均为1630 bp;序列比对结果表明,甘薯和巴西牵牛与裂叶牵牛、烟草等双子叶植物的18S rRNA基因相应序列的一致性均达98%以上,与单子叶植物Lilium superbum的18S rRNA基因序列也有较高的一致性。【结论】从两甘薯品种和巴西牵牛的基因组中克隆出了18S rRNA基因部分序列,研究结果不仅为利用18S rRNA基因作为内参基因分析甘薯和侵染甘薯病毒基因的表达研究提供了序列依据,而且可为甘薯和巴西牵牛的分子系统学研究提供序列参考。     

不同菌属的氟苯尼考耐药特点及floR基因的序列分析

为了解福建宁德地区猪源细菌对氟苯尼考耐药性及耐药基因floR的遗传特性。本研究从宁德地区6个猪场分别采集了50份仔猪粪便样品。从中分离得到氟苯尼考耐药大肠杆菌17株、沙门氏菌2株、肺炎克雷伯菌5株和鲍曼不动杆菌8株。并对其耐药基因floR进行同源性分析。结果显示,宁德地区猪源大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌对氟苯尼考的耐药检出率分别为34%、4%、10%和16%。且所有的分离细菌都呈现了多重耐药性。同源性分析发现不同细菌间的耐药基因floR存在高度同源性。这些结果表明氟苯尼考耐药基因floR广泛存在于不同细菌间,且可在不同细菌间进行水平传播。该研究为氟苯尼考耐药基因floR的广泛传播奠定了一定的理论基础,对临床合理用药提供了依据。     

鸡源大肠杆菌生物被膜的耐药性分析

为探讨鸡源大肠杆菌生物被膜的耐药机制,采用改进的平板培养法建立鸡大肠杆菌生物被膜体外模型,用液体二倍稀释法分别测定了鸡源大肠杆菌生物被膜菌、浮游菌和脱膜菌对克拉霉素、环丙沙星、磷霉素等13种抗菌药的敏感性,并检测了细菌生物被膜中超广谱β-内酰胺酶的产生情况。结果表明:浮游菌和脱膜菌对同种药物的敏感性几乎相同,而生物被膜菌对同种药物的耐药性比后两者显著增强,并且2株不产超广谱β-内酰胺酶的浮游菌在形成生物被膜后产生了超广谱β-内酰胺酶。由此说明,生物被膜菌的耐药性主要是由于生物被膜这种特殊结构造成的,同时,由于生物被膜的存在,促使了超广谱β-内酰胺酶的产生。生物被膜的形成和超广谱β-内酰胺酶的产生是鸡大肠杆菌生物被膜耐药的两个主要原因。     

大肠杆菌生物膜毒力基因的检测

通过确定大肠杆菌形成生物膜毒力基因的分布情况,为大肠杆菌生物膜的形成机理提供理论依据。本实验利用PCR聚合酶链式反应,对25株大肠杆菌阳性菌株菌进行了相关毒力因子fimH,Kp sMTII,chuA,fliC,yja和PapC的检测筛选。其结果显示：KpsMTII在所检测25株菌中出现的频率最高,占40%;其次是fliC,占32.5%,fimH占20%,合计占52.5%;chuA占7.5%,yja和PapC均未检出。结果表明：细菌粘附结构fimH基因和fliC基因是影响大肠杆菌形成生物膜的主要粘附结构毒力基因,其次是大肠杆菌毒力因子KpsMTII基因,最后是外膜蛋白血红素chuA基因。     

苦荬菜种子携带真菌与种子活力关系分析

摘要：【目的】明确苦荬菜种子携带真菌种类,探讨携带真菌与种子活力的相关性。【方法】采用洗涤检测法和PDA平板法对来源不同的3批苦荬菜种子贮藏前后携带真菌的种类和数量进行检测,同时对种子活力进行测定。【结果】来源不同的供试苦荬菜种子外部带菌和内部带菌量和种类差异显著。供试苦荬菜种子外部携带携带主要菌群为曲霉属（Aspergillus sp.）、青霉属（Penicillium sp.）、镰刀菌属（Fusarium sp. ）、枝孢属（Cladosporium sp.）;内部寄藏真菌的主要种类有曲霉属（Aspergillus sp.）、青霉属（Penicillium sp.）、镰刀菌属（Fusarium sp. ）、侧茁霉属（Pullularia sp.）。种子贮藏12个月后其带菌量均低于贮藏前,3批种子带菌量之间没有差异显著性,活力却有明显的差异（P〈0.05〉;【结论】种子携带真菌与种子活力的相关性分析表明,种子所携带的真菌是影响苦荬菜种子生活力的重要因素之一。     

缢蛏致病菌气单胞菌的分子生物学鉴定

从患病缢蛏（Sinvnovacula constricta）中分离到一株病原菌,暂命名为12#菌。对该菌株的16S rDNA的全序列进行PCR扩增并测序,然后用NCBIBLAST对测序结果进行比对。16S rDNA序列分析表明：12#菌与多株气单胞菌的16S rDNA的同源性均在95%以上。在细菌系统分类学中应归属于气单胞菌属。从构建的系统发育树中可以看出：12#菌与点状产气单胞菌（Aeromonas punctata）共同构成一个分支,且该菌株与点状产气单胞菌（Aeromonas punctata）的16S rDNA同源性达到99%以上,由此可以初步认为该菌为点状产气单胞菌（Aeromonas punctata）。     

中华鳖3种细菌的鉴定及致病性研究

针对一例中华鳖(Trionyx sinensis)爆发性死亡疾病,本研究旨在寻找其致病因子,明确分离菌的生物学地位、致病性和耐药特征。从患病中华鳖体内获得菌株C1、C2 和C3,经人工回归感染健康鳖,测定分离菌的致病作用;经形态学观察、生理生化鉴定及16S rRNA测序,结合系统发育学分析,做菌种的归类判定;用琼脂扩散(K-B)法测定菌株对抗生素药物的敏感性。分离纯培养的3 株菌分别为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae);能引起中华鳖急性感染性疾病,3 种菌共同致病死亡率最高,可达100%。药敏试验结果显示：弗氏柠檬酸杆菌对头孢他啶、头孢曲松、左氧氟沙星高度敏感,对万古霉素等17 种药物耐药;摩氏摩根氏菌对头孢他啶和头孢曲松高度敏感,对克林霉素等17 种药物耐药;肺炎克雷伯氏菌对恩诺沙星等13 种药物敏感,对青霉素等6 种药物耐药。本研究所检出的弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根氏菌和肺炎克雷伯氏菌为该例中华鳖爆发性死亡疾病的病原菌,3 菌混合致病力强于单一菌液。弗氏柠檬酸杆菌和摩氏摩根氏菌呈现高度多重耐药,肺炎克雷伯氏菌耐药趋势异于前两者,表现为弱耐药株。     

瓜类尖孢镰刀菌致病物质β-D-葡萄糖苷酶活性与致病性的相关性分析

【研究目的】研究瓜类尖孢镰刀菌β-D-葡萄糖苷酶活性与致病性的关系,为菌株致病性强弱快速测定提供一种新的辅助方法;【方法】测定了19株来自不同瓜类寄主尖孢镰刀菌菌株的致病性及致病物质β-D-葡萄糖苷酶活性,构建菌株的发病率(y)与酶活(x)的曲线模型;【结果】菌株致病性测定结果表明,同一寄主及不寄主来源的菌株致病性有差异。供试菌株中有12个强致病菌株,发病率在80%以上;2个中等致病菌株,发病率分别为60%和70%;2个弱致病菌株发病率均为30%,以及3个非致病菌株。菌株β-D-葡萄糖苷酶活测定结果表明,同一寄主不同菌株的酶活存在明显差异,来自黄瓜、甜瓜和西瓜寄主菌株酶活变化范围依次为（21.57-54.89）、（16.28-41.83）和（14.98-32.43）U•ml-1;不同寄主（黄瓜、甜瓜和西瓜）菌株的β-D-葡萄糖苷酶活也存在差异,平均酶活为黄瓜（34.08 U•ml-1）甜瓜（27.86 U•ml-1）西瓜（20.95 U•ml-1）;【结论】菌株的β-D-葡萄糖苷酶活性与其致病性关系分析表明,当酶活性小于30 U•ml-1l时,菌株发病率与酶活呈正相关;当酶活大于30 U•ml-1,菌株的发病率大于90%。     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因克隆及序列分析

【目的】对牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因进行克隆及序列分析，为阐明本病致病机理，更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据。【方法】以牛病毒性腹泻病毒河北分离株（HB-DCZ）基因组RNA为模板，扩增BVDV HB-DCZ株基因组NS2-3片段cDNA。将PCR产物克隆后进行PCR及双酶切鉴定。克隆产物进行序列测定及分析。【结果】HB-DCZ cDNA体外扩增获得特异性条带，大小约为665bp，表明该分离毒株基因组中无插入序列。PCR产物克隆，提取重组质粒，扩增获得特异性的DNA条带，长度约为665bp，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，获得两条DNA片段，长度分别为2600bp和702bp左右，与理论值相符。序列测定结果表明，克隆得到的NS2-3重要区扩增片段共665核苷酸，NS2-3重要区的蛋白质由208个氨基酸残基组成。HB-DCZ毒株NS2-3重要区核苷酸序列与已公开发表的BVDV其他毒株相比的同源性依次为184株99.1%，ZM195株97.4%，Osloss株92.3%，C24V株77%，NADL株76.4%。HB-DCZ在NS2-3扩增区域中既没有外源序列的插入，也没有基因重组、重排或缺失，但存在某些核苷酸的替换。【结论】HB-DCZ与Osloss株、国内的184株、ZM195株遗传距离较近，与C24V株、NADL株遗传距离较远。HB-DCZ株应为BVDV Ib基因亚型。     

IBDV HI株VP2基因的原核表达

【研究目的】为了研究鸡传染性法式囊病毒的分子生物学特性,【方法】应用反转录（RT—PCR）技术从河南传染性法式囊发病鸡中总RNA克隆出1461bp的VP2基因,并将其克隆于pET-28a载体,筛选并构建了pVP2表达载体。【结果】经IPTG诱导后,在其宿主菌BL21（DE3）中成功表达了53．7ku蛋白。【结论】经SDS—PAGE和Western blotting分析,VP2表达产物以包涵体形式存在,并与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。     

茄科作物青枯病原菌的脂肪酸鉴定

【研究目的】采用脂肪酸鉴定技术对茄科作物青枯病原菌进行鉴定,以期为青枯病的预防与防治提供技术支持。【方法】采用选择性培养技术对茄子、番茄和辣椒病株进行青枯病原菌的分离和纯化,而后对青枯病原菌进行脂肪酸鉴定。【结果】经选择性培养分离得到的36株青枯病原菌中,有33株鉴定为典型的青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）,占91.67%;茄子、番茄和辣椒上的青枯病原菌被鉴定为青枯雷尔氏菌的比例分别为100%、90%和89.47%。【结论】脂肪酸鉴定技术具有快速性、准确性,并可通过计算机的运用使分类达到数据化、自动化,可在茄科作物青枯病的检测中得到广泛的应用。     

棉铃疫病人工接种方法优化及应用

【目的】棉铃疫病是严重危害棉花生产的铃部病害。本研究旨在优化棉铃疫菌(苎麻疫霉,Phytophthora boehmeriae)的人工接种方法并有效应用。【方法】在室内保湿培养条件下,比较了棉株不同部位健康成铃自身携带棉铃疫菌的情况;利用贴接棉铃疫菌菌盘的方法,比较了棉铃表面消毒和不消毒、有伤和无伤接种对棉铃疫病发病情况的影响;建立棉铃疫病人工接种方法并应用于防治棉铃疫病化学药剂筛选、棉花品种抗病性鉴定和棉铃疫菌致病力检测。【结果】田间棉株下部第1~3果枝铃的棉铃疫病发病率显著高于中部第4~6果枝铃、中部第7~9果枝铃和上部第10~12果枝铃;75%(体积分数,下同)酒精浸泡棉铃2 min能够有效杀死棉铃表面携带的棉铃疫菌和其他真菌等杂菌;有伤接种棉铃疫菌,棉铃疫病发病快且均匀。建立了棉铃疫病快速人工接种方法:选取棉株中部第4~9果枝上的健康带柄成铃,去掉苞叶,用75%酒精浸泡消毒2 min,在棉铃中上部铃缝处针刺接种棉铃疫菌,25℃保湿培养3~7 d即可完全发病。应用优化的棉铃疫病人工接种方法筛选、鉴定结果表明,12种化学杀卵菌剂中,对棉铃疫病防效理想的药剂为25%(质量分数,下同)甲霜·霜霉威可湿性粉剂、70%丙森锌可湿性粉剂和52.5%噁酮·霜脲氰水分散粒剂;16个棉花品种对棉铃疫病存在抗性差异;10个棉铃疫菌菌株中JP18-4的致病力最强,JP15-2对棉铃的致病力最弱。【结论】本研究优化建立了棉铃疫病人工接种方法。该方法在7 d内即可完成棉铃疫病相关试验的评价,为加快棉铃疫病防治药剂筛选、棉花品种抗病性鉴定和棉铃疫菌致病力检测提供可行的技术。     

鸡源沙门氏菌多重耐药和Ⅰ型整合子的流行调查

为了研究沙门氏菌多重耐药性与Ⅰ型整合子的流行情况,本研究从山东省鸡场分离沙门氏菌,根据Kauffmann-White方法测定其血清型,采用微量稀释法测定了沙门氏菌对19种常用抗菌药物的MIC值,并且采用PCR技术测定了Ⅰ型整合子及其携带的耐药基因盒。结果显示：本次分离得到311株沙门氏菌,包括印地安纳沙门氏菌（133株）和肠炎沙门氏菌（178株）2种血清型;药物敏感性试验表明：分离菌株对磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、萘啶酸、氨苄西林、四环素、多西环素和甲氧苄啶普遍耐药,菌株多重耐药率为91.0 %(283/311),99%的分离株对阿米卡星、多黏菌素敏感;PCR测定Ⅰ型整合子结果：Ⅰ型整合子的检出率为65.0%(202/311),其中多重耐药表型菌株Ⅰ型整合子阳性率为92.6%,202株整合子阳性菌株中有6株的携带基因盒dfr17-aadA5。上述结果表明,Ⅰ型整合子普遍存在于沙门氏菌中,并且与沙门氏菌的多重耐药性密切相关。