胡桃楸激素调控相关JmDELLA基因克隆与表达分析

为探讨胡桃楸激素调控相关JmDELLA基因在花芽性别分化过程中的调控机理,本研究从胡桃楸转录组测序数据库中筛选出与激素调控相关DELLA基因的差异片段,通过PCR扩增技术获得DELLA基因CDS全长序列,命名为JmDELLA (GenBank登录号:400411)。并利用生物信息学软件对JmDELLA基因进行生物信息学分析,利用RT-PCR对胡桃楸不同器官组织进行表达分析。克隆获得JmDELLA基因的CDS序列全长为1 842 bp,编码613个氨基酸,将该基因编码的氨基酸序列比对和聚类分析,结果表明该基因与核桃(Juglans regia)、薄皮山核桃(Carya illinoinensis)、杨梅(Morella rubra)亲缘关系同源性可以达到80%以上。RT-PCR表达分析表明胡桃楸激素调控相关JmDELLA基因在雌、雄花芽中表达量最高,因此推测该基因参与了胡桃楸花芽性别分化的整个过程。该结果为深入解析胡桃楸雌雄异型异熟性别分化的分子调控机理提供理论依据。     

家鸡2个Dmrt基因的序列分析

Dmrt基因编码的蛋白质是一个具DNA结合能力的转录调控因子,其DM结构域在不同进化类型的生物中具有相当的保守性。通过简并PCR克隆技术,扩增和克隆了家鸡基因组中的DM结构域,经序列分析,获得了两个具有不同DM序列的克隆,分别命名为GgDmrt2和GgDmrt5。联机与GenBank中不同进化地位动物的Dmrt基因进行聚类分析,结果显示,具有DM结构域的基因家族在两栖类、爬行类、鸟类中高度保守,并且存在着许多成员基因。     

家鸡2个Dmrt疗基因的序列分析

Dmrt基因编码的蛋白质是一个具DNA结合能力的转录调控因子,其DM结构域在不同进化类型的生物中具有相当的保守性.通过简并PCR克隆技术,扩增和克隆了家鸡基因组中的DM结构域,经序列分析,获得了两个具有不同DM序列的克隆,分别命名为GgDmrt2和GgDmrt5.联机与GenBank中不同进化地位动物的Dmrt基因进行聚类分析,结果显示,具有DM结构域的基因家族在两栖类、爬行类、鸟类中高度保守,并且存在着许多成员基因.     

荧光素酶表达载体yy621的构建及鉴定

在载体yy449的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间增加BglⅡ限制性内切酶位点,构建yy621载体。用PCR的方法分别扩增CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因。引物设计要满足如下条件:CaMV 35S minimal启动子序列扩增片段的上游应包括Bam HⅠ、下游应包括BglⅡ限制性内切酶位点;LUC基因序列扩增片段的上游应包括BglⅡ、下游应包括XbaⅠ限制性内切酶位点。以上两个片段先用BglⅡ限制性内切酶消化后进行连接,得到CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间含BglⅡ限制性内切酶的识别位点的片段,然后再用Bam HⅠ和XbaⅠ限制性内切酶进行消化,插入到载体yy449的Bam HⅠ和XbaⅠ酶切位点之间,替换原有的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列。经菌落筛选、PCR鉴定和测序验证,阳性菌落中的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间包含BglⅡ限制性内切酶的识别位点,载体yy621构建成功。本实验中构建的荧光素酶表达载体yy621,适于今后用抗性相关基因替换LUC基因,测定合成启动子对抗性相关基因的具体调控与赋予植物对不良环境的具体抗性表现,或者用全长启动子序列替换CaMV 35S minimal启动子序列(-46～+1),对进一步观察LUC基因的表达调控具有重要的意义。     

甜瓜单性花相关基因CmACS-7的分子标记开发与应用

甜瓜(Cucumismelo L.)性型中主要是雄花、两性花同株型(雄全同株,简称两性花),雌雄异花同株型(单性花)比较少见。甜瓜育种工作中为提高制种效率,往往将母本系转育成单性花。传统方法筛选单性花植株耗时长,占地面积大。根据CmACS-7基因序列设计引物进行PCR扩增,甜瓜9份材料均可获得188 bp的片段。多序列比对发现,材料单性花性状与扩增片段的碱基变异相关联,关联位点为限制性内切酶AluⅠ的识别位点。扩增产物进行酶切,甜瓜单性花材料CmACS-7基因的PCR扩增产物均可以被酶切成两条带(160 bp和28 bp),两性花材料CmACS-7基因的PCR扩增产物不能被酶切(188 bp),因此建立CmACS-7基因的CAPS分子标记。利用此标记对58份甜瓜材料进行验证,甜瓜单性花性状与分子标记结果显著相关。基于甜瓜单性花决定基因CmACS-7的CAPS分子标记可用于单性花的选育。     

绿色棉纤维发育过程中DNA表观遗传变化的甲基化敏感扩增多态性分析

【目的】分析绿色棉纤维发育过程中DNA甲基化状态差异。【方法】利用2组限制性内切酶Eco RⅠ/HpaⅡ和Eco RⅠ/MspⅠ对绿絮棉1号纤维基因组甲基化位点进行识别和切割,并采用甲基化敏感扩增多态性引物对切割产物进行扩增,分析基因组内5'-CCGG-3'位点的甲基化状态;同时对扩增的差异片段进行测序,分析其生物学功能。【结果】66对甲基化敏感扩增多态性引物共扩增出4112个条带;平均每个样品共扩增出822.4个带型,平均每对引物扩增出12.46个片段。随着绿色棉纤维的发育,甲基化条带总数、甲基化条带比率、全甲基化条带百分比均逐渐升高;其中,开花后10、15、20和25 d时甲基化条带总数分别比开花后5 d时增加11.45%,13.86%,20.10%和33.13%。与开花后5 d相比,开花后10、15、20和25 d时纤维DNA发生甲基化变化位点的比例分别为3.15%,3.43%,3.65%和2.52%;而去甲基化位点的比例分别为12.87%,14.72%,13.31%和48.81%。通过测序和Blast分析表明,17个片段与已知的功能基因同源性较高,包括棉花线粒体基因组、丝氨酸蛋白酶基因和酯酶基因,且这些基因均在开花后25 d发生去甲基化。【结论】绿色棉纤维发育过程中DNA发生了甲基化与去甲基化现象。     

基因沉默及其克服策略

基因沉默现象是导致转基因不能正常表达的主要原因,基因沉默发生在两种水平上,一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默,另一种是转录后基因沉默,有活跃的启动子,能转录外源基因,核内有正常水平的mRNA,细胞质不积累mRNA。消除甲基化的影响﹑避免使用同源和重复序列和使用核基质结合序列可有效克服基因沉默。     

牦牛ACTA1基因启动子区克隆、DNA甲基化与组织表达相关性分析

为了探究骨骼肌α肌动蛋白1(ACTA1)基因在肌肉和脂肪等6个组织中的甲基化状态及mRNA表达水平,以类乌齐牦牛、麦洼牦牛为研究对象,成功克隆了牦牛ACTA1基因启动子区序列,且采用重亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测ACTA1基因启动子区甲基化模式,并通过实时荧光定量PCR检测ACTA1基因在臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪组织中的mRNA表达水平。结果显示,牦牛ACTA1基因转录起始位点上游及第一外显子区部分序列总长为1 028 bp;BSP法分析发现肌肉组织DNA甲基化水平最低,脂肪组织甲基化率最高,其中,类乌齐牦牛臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪的甲基化概率分别为6.25%,6.88%,20.00%,16.25%,26.25%,29.38%,麦洼牦牛臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪的甲基化概率分别为5.00%,7.50%,18.13%,20.00%,26.25%,28.75%;ACTA1基因mRNA表达量在肾脏、肺脏、肝脏和脂肪均极显著低于臀大肌(P0.01),且显著低于心脏(P0.05),类乌齐牦牛和麦洼牦牛心脏mRNA表达量具有显著性差异(P0.05),类乌齐牦牛肺脏组织甲基化率显著低于麦洼牦牛(P0.05),其他各组织甲基化率和mRNA表达量差异均不显著(P0.05),各组织甲基化水平与ACTA1基因mRNA表达量呈极显著负相关(r=-0.797,P=0.002)。结果表明,ACTA1基因DNA甲基化模式对肌肉发育具有一定的调控作用,可为牦牛遗传育种表观遗传标记提供部分数据支持。     

谷子(Setaria italica)DNA甲基化修饰相关酶类基因的进化及表达分析

为系统研究谷子(Setaria italica)参与DNA甲基化修饰相关酶类的编码基因,本研究以测序品种‘豫谷1’为材料,水稻(Oryza sativa L.) DNA甲基化修饰相关酶类基因作为参考,运用序列比对和系统进化树构建的方法,得到13个参与谷子DNA甲基化修饰相关的酶类基因,这些基因与水稻的相应基因相似度为64%~80%。谷子与水稻中DNA甲基化修饰相关酶类基因在系统进化树上主要分成了三个进化枝,并且同功的DNA甲基化修饰相关酶类基因在分枝上彼此相邻。同时,实时荧光定量PCR筛选出13对在谷子中能成功扩增的引物,并对实时荧光定量PCR的程序进行确立和优化。本研究为深入开展谷子的表观遗传学研究提供了科学依据。     

无花果ACC合成酶基因克隆及序列分析

为进一步利用基因工程手段调控无花果乙烯的合成,以无花果果肉为材料提取基因组DNA,根据已报道的无花果ACC合成酶基因序列设计引物,采用PCR技术扩增得到一条约600 bp的特异片段,将该片段克隆到pGM-Teasy vector上经PCR、酶切和测序鉴定。序列分析结果表明,基因全长590 bp,编码196个氨基酸,该序列与GenBank上已登陆的Masui Dauphine-ACS1的cDNA序列同源性达99%,氨基酸同源性达98%。结果表明,成功克隆到了无花果ACS基因片段。     

家禽的性别决定和分化

家禽中虽未发现象哺乳动物SRY基因的性别决定片段,但XhoI家族中特异片段的发现可能成为性别决定基因研究的基础,性别分化的基础是控制性激素转型的芳香化酶;伴性遗传和泄殖腔鉴别法仍然是性别鉴定的主要方法;利用激素诱导只能使雌转雄而不能使雄转为雌,且转变后仍能恢复原来的遗传性别。性别决定与分化本质的发现是家禽性别控制研究的重要课题。     

加味玉屏风散对实验性免疫抑制黄鳝非特异性免疫功能的影响

【研究目的】研究了由黄芪、白术、防风、党参和甘草组成的加味玉屏风散对实验性免疫抑制黄鳝非特异性免疫功能的影响。【方法】阴性空白对照组只腹腔注射生理盐水,阳性空白对照组注射环磷酰胺,设低、中、高三个剂量阳性用药组注射环磷酰胺和加味玉屏风散,阳性用药对照组注射环磷酰胺和黄芪注射液,于第3d、第9d各注射一次,在第15d采样,分别测定脾脏体指数和抗氧化酶活性,并统计各组的死亡率。【结果】阳性空白对照组黄鳝与阴性空白对照组相比,死亡率显著升高（P<0.05）,脾脏体指数极显著降低（P<0.01）,抗氧化酶CAT、GSH-Px活性受抑制极显著（P<0.01）,SOD活性显著降低（P<0.05）。各用药组的死亡率均比阳性空白对照组的低,脾脏体指数和CAT、GSH-PX抗氧化酶活性均有回升,并接近或超过健康组;SOD活性则远超过健康组水平,其中尤以阳性用药低剂量组效果最为显著（P<0.01）。【结论】加味玉屏风散具有良好的增强黄鳝非特异性免疫功能的作用。     

四种淡水经济鱼类消化系统的组织学比较

鱼类消化系统的组织结构特点与食性密切相关,为了给开发不同食性淡水鱼的饲料做基础研究,以黄尾密鲴（Xenocypris davidi Bleeker）、白鲢（Hypophthalmichthys molitrix）、翘嘴红鲌(Erythroculter ilishaeformis Bleeker)、黄鳝(Monopterus albus)为研究对象,采用H.E染色法比较研究了其消化系统的组织结构特点。从比肠长、杯状细胞密度、黏膜肌层总厚度、黏膜皱褶数量和高度、肝胰脏结构等方面比较了其组织结构特征,探讨了组织结构特点与食性、环境的适应性之间的相关性。结果表明,黄尾密鲴和白鲢的比肠长在四种鱼类中最大,在设计黄尾密鲴和白鲢的饲料配方时应注重粗纤维的含量以增强适口性;消化道组织学结果表明,白鲢、翘嘴红鲌和黄鳝3种鱼的口咽腔上皮细胞中都不同程度发排列有杯状细胞,而黄尾密鲴则无,但黄尾密鲴的口咽腔的最厚,白鲢的鰓耙最发达,食道的输送食物的能力和肠的消化吸收能力由黄尾密鲴、白鲢、翘嘴红鮊、黄鳝依次减弱,消化腺的进化是伴随物种进化而进行的有一些进化和演化方面的特征,是按照黄尾密鲴、白鲢、翘嘴红鲌到黄鳝的方向进化。这些组织学特征都是适应鱼类食性与环境的结果,在设计饲料配方时需考虑鱼类的食性特点与生活环境。     

Validation of male sex‐specific UBC‐8071200 ISSR marker and its conversion into sequence tagged sites marker in Jojoba: a high precision oil yielding dioecious shrub

There is a recent surge in the marker‐assisted selection of desired sex type among economically important dioecious crops. Simmondsia chinensis (Jojoba), a dioecious crop is of immense agricultural importance where only the female plants are preferred for commerce. DNA fingerprinting technology, ISSR analysis along with bulk segregant analysis (BSA), has been carried out on a diverse set of 17‐ to18‐year‐old mature male and female plants of Jojoba to validate a male sex‐specific ISSR marker, UBC‐807₁₂₀₀ on larger population that comprises 330 female and 255 male plants of Jojoba. This male sex‐specific DNA fragment of ~1200 bp was cloned and sequenced. The sequence was found to be 1120 bp in length and based on the sequence information, a pair of sequence tagged sites primers was developed that amplified a single ~800 bp band, consistently only in all the male populations while no amplification was seen in their female counterparts. The marker was named as Jojoba Male Sex Marker which was further validated on 330 female plants from 22 genotypes and 255 male plants from 17 genotypes.     

Generation and validation of unique male sex-specific sequence tagged sites (STS) marker from diverse genotypes of dioecious Jojoba-Simmondsia chinensis (Link) Schneider

DNA fingerprinting studies have been carried out with the physiologically mature male and female plants of Jojoba using 80 ISSR primers with a view to generate sex-linked markers. After bulk segregant analysis, two unique ISSR markers, viz. ISSR848₁₅₀₀ and VIS11₁₃₁₇ have been developed which can be used for determining the sex at the seedling stage. Of the eighty primers tested on the pooled male DNA and pooled female DNA samples, six ISSR primers were found to be associated with sex expression. Of the six, only two primers ISSR848 and VIS11 generated unique male sex specific bands of ~1,500 and ~1,300 bp which were consecutively present in all the male genotypes and absent in all the respective female genotypes. The remaining four primers when tried on individuals of different genotypes were confined to their sex specificity in only two female genotypes and absent in their male counterparts. One of the male-sex specific markers, VIS11₁₃₁₇ has also been cloned and sequenced which showed homology with a sex linked gene, DD44 from dioecious Silene species. Furthermore, VIS11₁₃₁₇ was converted into a male sex-specific sequence tagged sites (STS) marker of 584 bp. The male specific STS marker thus developed has been verified and validated on 100 populations of male and female individuals from ten different genotypes of Jojoba to endorse the diagnostic reliability of the STS marker. This can gainfully be employed for screening of sex at seedling stage which would be quite helpful for uprooting the undesired plants, thereby, saving resources like labor, water, fertilizers and space for highly desirable female plants.     

新城疫病毒La Sota株HN基因的克隆与序列分析

旨在从分子生物学角度进一步研究新城疫病毒La Sota株HN基因,探究NDV La Sota HN基因的遗传变异情况。研究以试验室冻存的p NDV-HN为模版,根据Gen Bank中登录的NDV La Sota株序列设计引物扩增HN基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒p MD-NDV-HN进行测序分析。应用生物信息学软件对新城疫病毒Lasota株HN基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、糖基化位点、蛋白结构跨膜区分析及磷酸化位点预测分析。核苷酸序列测定结果表明:HN基因的序列长度为1743bp,该基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)总长为1716 bp,编码571个氨基酸。生物信息学表明:试验获得的HN基因具有6个潜在糖基化位点及12个半胱氨酸残基,第5个潜在糖基化位点(508-510 aa)发生缺失及第123位半胱氨酸残基被色氨酸残基取代。La Sota株HN基因编码的蛋白质中有29个丝氨酸、10个酪氨酸和16个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点。将试验获得的La Sota株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现,它们的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高均可达到99%,表明HN基因在种属间具有较高的保守性。研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。     

茶树硒营养代谢关键酶硒半胱氨酸甲基转移酶基因克隆及启动子结构分析

为探明茶树硒营养代谢关键酶基因硒半胱氨酸甲基转移酶（SMT,GenBank登录号： DQ480337）的表达调控规律,通过PCR和基因步移技术获得SMT的DNA全长和部分启动子序列,用PLACE、PlantCARE分析SMT内含子和启动子的序列,预测其顺式作用元件及功能。结果表明SMT基因全长5473bp,有7个外显子和6个内含子,内含子富含光响应元件,激素响应元件和抗逆性相关元件,通过基因步移法克隆得到的SMT启动子长375bp,除了含核心启动子保守元件TATA-box和CAAT-obx外,还有其它重要顺式作用元件,如光响应元件、低温响应元件和胚乳表达特异性元件等。植物硒营养代谢关键酶SMT启动子的克隆及结构分析为进一步揭示SMT基因的生物学功能和表达调控机制奠定了理论基础。     

休眠期后板栗混合花芽的转录组分析

板栗是中国重要的木本粮食作物,具有极高的经济价值,但板栗雄花比例远远高于雌花,是限制板栗产量的主要因素。为了从分子水平上探讨板栗雌雄花的发生机制,本研究利用高通量测序技术对休眠期后板栗的两种混合花芽的转录组进行比较分析。总计获得了3 772个差异表达基因,其中2 173个基因上调,1 599个基因下调。这些差异基因经过GO分类和KEGG pathway富集分析分别归类于47个GO term和251条代谢途径。从转录组数据中获得了春化、光周期、赤霉素(GA)等途径的开花相关基因,还鉴定多个开花相关内源激素途径的基因。将基因VIN3,GAI,ELF3,GID1的qPCR检测结果与其转录组测序结果进行比对,发现虽然两种检测结果在差异倍数上存在差别,但4个基因的表达量的总体变化趋势一致,说明转录组测序结果有较高的可信性。本研究结果为揭示板栗雌雄花性别比例调控机制和花期人工调控提供了一定的科学参考。     

CD169基因及其蛋白性质和结构的生物信息学分析

[目的]对猪CD169基因编码蛋白的性质及结构等进行分析、预测,并与人、鼠、牛等物种CD169进行了比较分析。[方法]利用生物信息学相关分析软件和比较基因组学方法对CD169基因序列和氨基酸序列进行氨基酸组成、磷酸化、糖基化和结构特征等进行分析和预测。[结果]生物信息学分析结果表明,猪CD169含有磷酸化和糖基化位点,具有信号肽结构和卷曲螺旋结构。[结论]该研究结果为深入研究CD169的受体功能、PRRSV感染的物种特异性或偏嗜性等提供有意的理论参考