不同来源水稻品种badh2基因的同源性分析

香味基因是香稻育种的关键。本研究采用香味基因Xiang7F/7R对来源于辽宁省农科院和牡丹江市场的9个水稻品种进行序列分析。结果表明:(1)9个水稻品种在近400 bp处均出现一条带。(2)序列同源性分析发现,稼禾1号和龙粳香1号出现8 bp的片段缺失和3 bp的碱基突变。(3)日本晴与NCBI上发布的日本晴在该基因位点上存在5个碱基的插入/缺失,同源相似性达到99%。(4)遗传距离和系统发育树均表明,稼禾1号和龙粳香1号的遗传距离为0,聚为同一分支。以上结果表明,香味基因对不同水稻品种具有较高的灵敏度,可用于香稻品种的筛选,进而为后续的香稻品种选育奠定基础。     

利用CRISPR/Cas9技术对水稻香味品质进行遗传改良

为了获得经济价值更高的香稻品种,利用成熟的CRISPR/Cas9技术,在水稻Badh2基因上设计sgRNA-E2和sgRNA-E3 2个靶位点,对超级稻品种龙粳31的香味品质进行改良,其中靶位点sgRNA-E2跨第2个内含子和第2个外显子,靶位点sgRNA-E3位于第3外显子区。经检测共获得有碱基突变的转基因植株6株,其中2个单株为纯合突变,4个单株为双等位突变。突变类型包括碱基缺失、插入及碱基变异,其中突变单株Badh2-E2-13有大片段缺失,为双等位突变,分别缺失64,108 bp。在转录水平上发现6个突变株系的Badh2基因表达量均比野生型显著降低(P0.05)。通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术检测T_0突变体种子的香味物质2AP含量,发现5个突变单株的2AP含量相对野生型显著提高(P0.05),2个突变单株达到阳性对照(信香粳1号)水平,其中1个相比阳性对照显著提高。通过对6个突变株系的T_1主要农艺性状的调查发现,3个株系在香味物质含量提高的同时主要农艺性状和野生型没有显著差异。进一步对T_1植株进行筛选,共获得了无转基因序列的突变单株10个。综上,利用CRISPR/Cas9技术成功对超级稻品种龙粳31的香味品质进行了遗传改良,实现了香味物质含量的显著提高,为香稻和超级稻的育种提供了基础材料。     

小麦黄色花叶病毒RNA2自然缺失突变体的筛选和定位分析

许多真菌介体传播的病毒在机械接种过程中易于发生自然缺失。利用在小麦上连续机械接种WYMV的方法,自第27代起,利用RT-PCR和Northern blot方法在感病小麦中检测到一个WYMV RNA2的缺失突变株,序列分析发现缺失区域位于RNA2的214~2 808 nt,共计2 595 nt,并在缺失区域的两端存在7个碱基的反向互补序列。缺失区域上游紧邻这7个碱基双链区存在一富含AU的短序列,并据此对此D-RNA2的缺失机制进行了讨论。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得水稻GRAS家族转录因子G540突变体

GRAS转录因子是植物特有转录因子,一般由保守的GRAS结构域组成,与光信号转导、赤霉素信号转导、植物生长发育及植物逆境胁迫响应密切相关。水稻GRAS转录因子G540中含有2个RPT1结构域和2个GRAS结构域,系统进化分析和表达模式分析发现,G540属于GRAS转录因子家族中的HAM亚家族,在水稻穗早期发育阶段特异表达,推断G540可能参与穗的早期分化或形态建成。本研究利用CRISPR/Cas9技术对G540进行定点编辑,构建G540基因敲除载体并利用农杆菌介导转化水稻粳稻品种‘9522’,鉴定并获得遗传转化植株。对转化植株的靶序列进行分析发现,9522G540-1在靶序列上缺失了第4位C碱基,9522G540-4在靶序列的第3位和第4位之间插入了一个A碱基,9522G540-2在G540的双等位基因上出现了不同的突变,一条链在靶序列上缺失了第4位C碱基,另一条链在靶序列上缺失8个碱基。对G540突变后的氨基酸序列分析发现,9522~(G540-1)、9522~(G540-2)和9522~(G540-4)的RPT1和GRAS结构域完全缺失,即成功获得以‘9522’为背景的G540功能缺陷型突变体。为进一步探究该基因在穗发育进程中的生物学功能和分子机制提供遗传材料。     

利用CRISPR/CAS9基因编辑技术创制香型郑稻19新种质

有特殊香味的稻米深受我国消费者欢迎,是优质水稻的重要指标之一,本研究通过基因编辑创制香型优质水稻新种质。水稻中甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2是控制香味的关键基因,以适于直播品种郑稻19为供体材料,利用CRISPR/CAS9技术定点突变水稻Badh2基因。获得T0代转基因阳性植株11株,其中9株子粒有香味,检测6个香型T1株系靶点序列,6个株系均发生突变,发现7种突变类型,5种是缺失类型,2种插入类型,其中3个株系（T1-2、T1-3和T1-7）出现双等位突变。6个T1代株系共测序22个单株,检测到纯合突变10株;T2代检测28株,其中纯合突变21株。以潮霉素抗性基因引物检测T1-2、T1-6和T1-7株系后代单株载体脱落情况,T1代3个株系未获得无载体纯合突变单株,T2代中获得8株无载体纯合突变单株,来源于T1-2株系有3株,来源于T1-7株系5株。T0代9株香型单株子粒2-AP含量1.259±0.072μg/g,T1代8个突变株系2-AP含量0.537±0.111μg/g,均显著高于对照郑稻19。考察中选T1-2、T1-7株系的农艺性状,与郑稻19无显著差异。这些无载体突变单株可作为香型种质在种质创新和育种中应用。     

27种香稻品种badh2突变位点序列的分析

水稻甜菜碱醛脱氢酶2基因(Badh2)第7外显子和第2外显子的突变是导致稻米变香的主要原因。本研究分别对包含第7外显子或第2外显子的PCR产物进行测序分析,以明确27种适宜海南省种植的香稻品种的Badh2的突变序列。研究结果表明:海香5701、山栏香糯、海香6309等20个品种Badh2基因的突变类型为第7外显子发生了8 bp的缺失和3个碱基的突变,所有27个水稻香稻品种第2外显子序列都未发生改变。本研究结果可为这些香稻品种的保护与鉴定、及作为香味基因供体改良其他优良品种奠定基础。     

7份贵州禾香味鉴定及OsBADH2基因CDS差异分析

水稻OsBADH2基因功能丧失是稻米产生香味的内因。本研究对7份贵州禾和2份对照品种的香味性状进行物化鉴定,发现榕禾与2个对照品种为香稻,其余6份贵州禾都为非香稻。为解析贵州禾产生香味与OsBADH2基因的内在关系,通过TA克隆、测序分析和序列拼接,本研究获得9份材料OsBADH2基因CDS的序列信息,采用Megalign软件对其进行序列比对分析。结果表明:4份贵州禾(白香禾2号、半坡禾、黎平禾1号和黎平禾2号)的OsBADH2基因CDS无突变;榕禾和2个对照品种的CDS差异都为第7外显子的8 bp缺失和3 SNP;还发现2种新的CDS差异(白香禾1号为1 bp缺失和1 SNP,便禾为2 bp缺失和2 SNP)。这些结果为贵州禾香味品种保护及育种改良提供理论基础。     

利用CRISPR/Cas9技术获得水稻恢复系Bsr-d1基因突变体

为研究水稻抗稻瘟病基因Bsr-d1在杂交水稻恢复系中的功能,我们利用CRISPR/Cas9定点基因编辑方法,设计2个敲除靶标位点,构建了Bsr-d1基因编辑载体,并通过农杆菌介导的方法转化水稻恢复系品种‘GH998’,成功获得了转基因植株,并在T1代筛选到4个无转基因成分的纯合突变株系。纯合突变株系有4种突变类型,包括第199号碱基处缺失17个碱基、第212号碱基处缺失4个碱基、第216号碱基处插入1个碱基、第216号碱基处插入2个碱基突变类型。通过蛋白序列分析,发现纯合突变株系都存在移码现象导致氨基酸变化并提前终止翻译。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除水稻恢复系‘GH998’中Bsr-d1基因,获得无转基因成分的纯合突变株系,为进一步研究Bsr-d1基因在杂交水稻上的功能提供了理论依据和品种资源。     

水稻中脉缺陷突变体dl-6的遗传分析与精细定位

为了克隆DL-6基因,以dl-6与9311配制正反杂交组合进行性状分析发现,dl-6突变性状受1对隐性核基因控制,利用SSR分子标记将控制dl-6性状的基因DL-6初步定位在水稻第3染色体的短臂上,进一步利用新发展的InDel标记将DL-6基因精细定位在I3-5和I3-8之间85 kb的物理距离内。对该区段内存在的开放阅读框( ORF)进行分析,发现其中ORF9编码的YABBY基因是一个与叶脉发育相关的基因,对突变体dl-6和野生型中YABBY基因进行测序,将测序结果与数据中日本晴序列进行比对发现,突变体dl-6中YABBY基因的第1个外显子存在1个单碱基突变,该突变导致野生型中编码的半胱氨酸突变为突变体中的精氨酸;同时突变体dl-6在YABBY基因的3′端还存在8个碱基的缺失。这2个突变位点哪个是导致dl-6突变的功能区目前还不确定,有待进一步研究。     

蒙古羊BMP15基因外显子1位点多态性与产羔性能关系分析

采用PCR-SSCP技术对蒙古羊BMP15基因外显子1位点的单核苷酸多态性(SNP)进行了检测,并对其与产羔性能关系进行了分析.结果表明,在所检测的116个蒙古羊个体中,BMP15 基因在该位点均呈现多态性,具有 、A 和AA 3种基因型.测序分析表明,该段DNA序列中存在3个碱基的缺失,即编码区第28,29,30位碱基缺失,这个突变使野生型( )氨基酸序列上相应的10号氨基酸残基亮氨酸(L)缺失,变成了突变基因型(AA),形成B1突变体;群体遗传学分析表明,B1突变在双羔系中的发生频率高于单羔系中发生的频率,χ2适合性检验结果表明,两品系在该位点具有中度多态性并处于Hardy-Weinberg平衡状态(p＞0.05);与产羔性能关系分析表明B1突变对蒙古羊产羔数无显著影响(p＞0.05).     

TaMyb2-Ⅱ基因在普通小麦(Triticum aestivum L.)及其近缘种中的单核苷酸多态性分析

以39份抗旱性不同的普通小麦、5份A基因组材料、4份拟斯卑尔脱山羊草（Aegilops speltoides）、6份粗山羊草（Aegilops tauschii）和2份四倍体小麦,分析TaMyb2基因的核苷酸序列长度多态性和单核苷酸多态性,及其与抗旱性的关系。结果发现,TaMyb2在A基因组材料中无目标片段扩增,在其他材料中检测到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3种类型序列。经详细分析,TaMyb2-Ⅱ序列长1 606 bp,在供试材料77 088 bp的核苷酸序列中包括34个单核苷酸变异,其中26个SNP,8个InDel,二者出现的频率分别为1/2 965 bp和1/9 636 bp,编码区π值（0.00055）小于非编码区的π值（0.00185）, 说明编码区的遗传变异小于非编码区的遗传变异。从SNP水平上分析,发现普通小麦与其D基因组供体种粗山羊草及四倍体小麦的亲缘关系较近,与B基因组供体种拟斯卑尔脱山羊草的亲缘关系较远。48份材料的TaMyb2-Ⅱ序列共分为18个单倍型（haplotype）,其中haplotype 2、3、5、6、8、9均为旱地栽培的普通小麦品种,说明普通小麦TaMyb2-Ⅱ的这几个haplotype结构可能与抗旱性有关。     

小麦地方品种高分子量谷蛋白亚基多样性分析

采用SDS-PAGE方法,对我国9个麦区的76份代表性地方品种的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)组成比较分析,并探讨其与环境因素(平均海拔、年平均降雨量和年平均温度)的相关性。结果表明,25.0%的品种具有异质性,分别包含2~4种不同HMW-GS组合;在Glu-1位点共检测到14个等位变异,其中Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1等位变异数分别为2、7和5;发现了3个新等位变异,包括Glu-B1位点2个和Glu-D1位点1个。所有等位变异构成16种不同的亚基组合类型,以(N, 7+8, 2+12)为主,频率为69.7%。在Glu-1位点上,不同麦区遗传多样性分布存在一定的不均衡性,年平均降雨量和年平均温度与麦区多样性指数呈负相关。推测环境压力可能是地方品种多样性地区分化的重要因素。     

粗山羊草抗小麦白粉病基因遗传多样性的研究

粗山羊草(Ae.tauschii(Coss.)Schmal.)是普通小麦(T.aestivum L.)抗性改良的宝贵遗传资源。本研究对来自伊朗、前苏联等8个国家和地区的78份粗山羊草进行了小麦白粉病(powderymildew)混合菌种苗期接种鉴定,表现免疫或近免疫的有45份,占57.69％;用一套白粉病菌菌株(共16个)对原产地不同的11份粗山羊草分别进行苗期接种鉴定,结果表明除Y168表现感染外,其它10份材料表现出各自不同的抗性反应,只有来自伊朗的Y219、Y221、Y225和来自的苏联的Ae37能抗所有16个菌株,而没有感染的毒性菌株,说明它们可能含有新的不同于15个已知Pm基因的抗性基因。利用完全双列杂交对原产地不同的5份粗山羊草进行了苗期抗白粉病基因的遗传分析,出现3种不同的抗性基因类型,来自伊朗的3份材料表现单显性(PmA)或双显性(PmA、PmB)2种类型,而来自前苏联的2份材料表现出不同于前两种类型的另一种单显性(PmB)类型。从而为增加普通小麦抗白粉病基因的遗传多样性奠定了基础。     

应用SSR分子标记分析国外种质对我国小麦品种的遗传贡献

利用363对SSR标记分析了在我国小麦生产和育种中发挥了重要作用的11份国外引进品种和33份选育品种的遗传组成,旨在揭示国外种质对我国小麦品种改良的遗传贡献,指导种质资源引进和利用。国外种质包含了选育品种所发现等位变异的76.3%。与不同时期小麦品种等位基因多样性比较发现,国外种质的平均等位变异数最多(3.92),20世纪60年代(2.86)和70年代(3.01)基本一致,80年代有所升高(3.46)。品种间遗传距离比较与品种等位基因多样性结果相吻合。比较引进和选育品种在SSR位点的等位变异频率变化,发现至少在33个SSR位点,国外种质等位变异在我国小麦育种中被优先选择(该等位变异在引进和选育品种的分布频率均高于70%),其中一些位点已知与产量、生育期和抗病等性状密切相关。表明引进品种在以上基因组区域对我国小麦品种具有非常高的遗传贡献。     

应用SSR分子标记分析国外种质对我国小麦品种的遗传贡献

利用363对SSR标记分析了在我国小麦生产和育种中发挥了重要作用的11份国外引进品种和33份选育品种的遗传组成,旨在揭示国外种质对我国小麦品种改良的遗传贡献,指导种质资源引进和利用。国外种质包含了选育品种所发现等位变异的76.3%。与不同时期小麦品种等位基因多样性比较发现,国外种质的平均等位变异数最多(3.92),20世纪60年代(2.86)和70年代(3.01)基本一致,80年代有所升高(3.46)。品种间遗传距离比较与品种等位基因多样性结果相吻合。比较引进和选育品种在SSR位点的等位变异频率变化,发现至少在33个SSR位点,国外种质等位变异在我国小麦育种中被优先选择(该等位变异在引进和选育品种的分布频率均高于70%),其中一些位点已知与产量、生育期和抗病等性状密切相关。表明引进品种在以上基因组区域对我国小麦品种具有非常高的遗传贡献。     

小麦转录因子基因TaNAC67参与调控穗长和每穗小穗数

NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,在植物生长发育和逆境胁迫应答反应中发挥着重要作用。前期研究表明, TaNAC67参与对多种逆境胁迫的应答,过量表达能增强拟南芥的抗逆性。为进一步揭示其在调控小麦主要农艺性状发育方面的作用,本研究以36份普通小麦组成的高多态性群体为材料,测序分析了TaNAC67-6A、TaNAC67-6B、TaNAC67-6D序列多态性,发现TaNAC67-6A启动子区–1516 nt有1个A/G转换SNP,在–873～–748 nt处有1个126 bp的InDel; TaNAC67-6B启动子区–2014和–1916 nt处各有1个C/T转换SNP; TaNAC67-6D启动子区–1795 nt有1个T/G颠换SNP,编码区357 nt处有1个C/T转换SNP。根据多态性分别开发了功能分子标记,扫描由282份普通小麦构成的自然群体,并将基因型和表型性状检测结果进行关联分析,TaNAC67-6A、TaNAC67-6B的标记与表型性状无显著关联,而TaNAC67-6D的2个标记SNP-D-1和SNP-D-2分别与小麦穗长和每穗小穗数显著相关。单倍型分析发现,自然群体中存在3种主要单倍型,其中Hap-6D-3是增加穗长和每穗小穗数的最优单倍型,在我国小麦育种历史中受到了正向选择。转基因水稻表型分析发现,TaNAC67过表达能显著增加水稻主穗穗长、穗分枝和穗粒数,验证了小麦关联分析结果。因此,TaNAC67-6D可用于改良农作物穗部性状,其分子标记可用于小麦分子标记辅助选择育种。     

小麦果聚糖合成酶基因6-SFT-D多态性及其与6-SFT-A2的累加效应

小麦6-SFT是果聚糖合成的关键酶基因。以23份六倍体普通小麦(AABBDD)、5份D基因组材料(DD)为多样性代表群体材料,通过测序分析小麦6-SFT-D基因的序列多态性,根据多态性开发6-SFT-D基因的功能标记,分析由154份六倍体普通小麦构成的自然群体的6-SFT-D基因单倍型(haplotype)与表型性状的关联特性和基因累加效应。在28份多样性代表群体中,共检测到6-SFT-D基因的4个多态性位点,均为单核苷酸多态性(SNP)位点,构成3种6-SFT-D基因单倍型;而在自然群体中只检测到6-SFT-D的两种单倍型。根据6-SFT-D基因2850 bp位点的T/C变异开发等位变异特异PCR标记。关联分析表明,6-SFT-D单倍型分别与灌溉条件下的千粒重和穗长显著关联,单倍型Hap I是提高千粒重的优异等位变异;在雨养和灌溉条件下,同时具有6-SFT-D与6-SFT-A2优异等位变异小麦材料的千粒重显著高于其他基因型材料,说明6-SFT-D和6-SFT-A2优异等位变异对于提高千粒重表现累加效应。     

小麦TaPK7基因单核苷酸多态性与抗旱性的关系

以抗旱性不同的45份六倍体小麦和5份小麦的二倍体近缘种为材料, 通过测序检测TaPK7基因的单核苷酸多态性, 研究了TaPK7基因多态性与抗旱性的关系, 旨在为发掘利用小麦抗旱基因资源奠定基础。50份材料TaPK7序列总长220 448 bp, 其中有64个SNP和9个InDel, 二者的频率分别为1 SNP/3 445 bp和1 InDel/24 494 bp。编码区的核苷酸多样性π值小于非编码区, 可能是由于编码区承受的选择压力较大。同义突变(Ka)与非同义突变(Ks)比值是0.415, 表明该基因受负向选择影响, 属于相对保守基因。在编码区检测到16个单核苷酸突变, 多存在于抗旱材料中。共检测到21种单倍型, 其中5种为强抗旱材料单倍型, 2种为干旱极敏感材料单倍型, 11种中等抗旱材料单倍型, 另外3种单倍型中同时包括抗旱材料和干旱敏感材料, 初步揭示了TaPK7基因的单核苷酸多态性与抗旱性相关。     

新麦草Psathyrostachys juncea遗传变异的细胞学和分子的分析

本文用染色体C分带、同功酶和RAPD技术分析了来自不同地理分布的新麦草不同材料的单株,观察其c带的多态性,即同源染色体的配对,相同材料的不同个体之间,同一地区不同材料之间,以及不同来源的材料之间的多态性。10个同功酶揭示了14个假定标记位点,其中11个显示了多态性(平均66.2％,每个位点具2.6个等位基因)。大量的等位变化发生在多数的多态位点上。在所用试材中有近90％的等位变化。在优化条件下,200个测试引物中有55.5％的材料间产生了多态性的RAPDs带型。在同一材料中和不同材料间分别有55.7％和47.8％的扩增片断是多态的。C—带、同功酶和RAPD分析结果是互相确证而高度一致的,为新麦草的遗传变异提供了模式。 新麦草具有抗旱、耐盐碱和抗黄矮病的特性,可以在小麦育种工作上加以利用。     

Allelic variation and genetic diversity of high molecular weight glutenin subunit in Chinese endemic wheats (Triticum aestivum L.)

The high molecular weight glutenin subunit (HMW-GS) compositions of 66 Chinese endemic wheats were determined by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Ten alleles at the Glu-1 loci were detected in 50 Tibetan weedrace wheat accessions which in combination resulted in seven different HMW-GS patterns. Four HMW-GS patterns were observed among 10 Yunnan hulled wheat accessions, and two patterns in six Xingjiang rice wheat accessions. Two novel alleles (Bx7** + By8, Bx7 + By8**) and two rare alleles (Dx2 + 1Dy12*, Dx2 + null) were found in Tibetan weedrace accessions, with one of the latter (Dx2 + Dy12*) also being found in Yunnan hulled wheat. The mean indices of genetic variation at the Glu-1 loci in Yunnan hulled wheat, Tibetan weedrace wheat and Xingjiang rice wheat were 0.2232, 0.1655 and 0.0926, respectively, showing that Yunnan hulled wheat and Tibetan weedrace wheat had higher genetic variation than Xingjiang rice wheat.