HLXN基因产物人羧肽酶A抑制剂的表达与纯化

目的：表达并纯化HLXN编码蛋白latexin。方法：用IPTG诱导含重组质粒HLXN—pQE30的E．coli M15表达latexin蛋白；HiTrap^TM Chelating层析柱纯化基因工程his6-latexin蛋白；SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量；考马斯亮蓝法测定超滤液中蛋白浓度。结果：由HLXN表达产物制备和提纯得到了纯化his6-latexin蛋白；该蛋白的分子量为32kD;蛋白含量为2．67g／L。结论：HLXN编码蛋白latexin的成功表达与纯化为进一步研究探讨HLXN基因的生物学功能、与人类临床疾病的关系以及在临床的应用奠定了基础。     

牙鲆细胞因子M17蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

M17是鱼类细胞因子IL-6亚族家族的成员之一，具有细胞因子样功能，在鱼体内发挥抗病毒和抗细菌的作用。为了制备牙鲆(Paralichthys olivaceus)M17蛋白的多克隆抗体，将M17基因插入pET-32a原核表达载体，构建M17基因原核表达质粒p ET-32a-M17。将构建的质粒pET-32a-M17转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，通过IPTG诱导M17蛋白表达，利用NiNTA亲和层析柱纯化M17重组蛋白。利用纯化的重组M17蛋白免疫小鼠获得M17多克隆抗体(抗血清)。结果显示，IPTG诱导后M17蛋白分子质量大小约为50.0 ku,M17重组蛋白主要以包涵体表达为主；Ni-NTA亲和层析柱纯化后透析复性后M17重组蛋白浓度为597μg·mL^-1；多克隆抗体经双向琼脂免疫扩散法检测抗体效价为1∶16，经Western blotting分析可见单一目的条带，说明制备的多克隆抗体具有较强的特异性。综上可知，M17重组蛋白表达成功，且制备的抗M17多克隆抗体可用于M17蛋白的生物学功能研究。     

GST-Dot4融合蛋白的表达·纯化及鉴定

[目的]为了提高Dotg蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并获得较高纯度的蛋白。[方法]以pGEX—KG—Dot4重组质粒转化EcoliBL21后,用IPTG诱导重组菌表达GST—Dot4融合蛋白,采用SDS—PAGE及WesternBlot法鉴定表达产物,用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱分离纯化。[结果]pGEX—KG—Dot4重组表达载体在大肠杆菌中获得高效表达;经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得了高纯度的Dot4融合蛋白;WesternBlot表明,该蛋白可与GST标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。[结论]在大肠杆菌中表达纯化后得到较高纯度的GST—Dot4融合蛋白,为Dot4蛋白的结构、功能及作用机制研究奠定了基础。     

拟南芥中 Fibrillarin 基因的克隆.表达.纯化及与 ak6 蛋白相互作用研究

[目的]研究拟南芥中Fibdllarin基因的克隆、表达及纯化，并探索其与ak6蛋白的相互作用。[方法]利用pGEX-6P-1与Fibrilla—r流基因构建重组表达质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达，运用同样方法构建PET-28a—ak6原核表达质粒，获得His—ak6融合蛋白，并运用体外pulldown技术验证二者的相互作用。f结果l在温度为37℃、诱导时间为16～20h、IPTG浓度为0．5mmol／L时，fibrillarin蛋白的纯化浓度最高。试验成功获得了符合标准的RNA，并获得了与预期片段大小相符的清晰的目的条带；pull—down试验结果表明，拟南芥中fibrillarin蛋白与ak6蛋白具有相互作用。[结论]拟南芥ak6突变体植株可能由于ak6的缺失影响了rRNA前体的加工，从而抑制核糖体的合成，进而阻碍拟南芥茎的生长，使植株表现明显的矮小症状。     

虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达和蛋白纯化

利用PCR技术从FPV-HLJ株病毒细胞培养物中扩增VP2基因主要抗原表位区片段VP2’。扩增片段克隆至pMD18-T载体,经核苷酸序列测定确认后,亚克隆于pGEX-6p-1原核表达载体,构建pGEX-6p-VP2’重组原核表达质粒。将该质粒转化至表达菌BL21(DE3)中用IPTG进行诱导表达。表达蛋白采用切胶法纯化,并用SDS-PAGE和Westernblot检测纯化蛋白纯度和抗原特异性。结果表明,VP2基因全长1200bp,编码400个氨基酸。重组菌可表达相对分子量约为66kD的融合蛋白,包括目的蛋白40kD和GST标签26kD。该蛋白以包涵体形式存在,且GST融合蛋白具有良好抗原特异性。     

A型流感病毒PB1-F2蛋白的原核表达、纯化及鉴定

对A型流感病毒PB1-F2蛋白进行了原核表达及纯化,获得了谷胱甘肽硫转移酶(GST)-PB1-F2融合蛋白,以用于研究流感病毒PB1-F2蛋白的功能及分子作用机制。以RT-PCR方法扩增PB1-F2基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上。重组质粒pGEX-6P-1-PB1-F2转化大肠杆菌(Es-cherichia coli)菌株BL21,并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot试验鉴定。结果显示,大肠杆菌细胞经诱导,表达出了相对分子量约为36kDa的蛋白,与GST-PB1-F2融合蛋白大小相符;Western blot鉴定显示,该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别。试验在大肠杆菌表达系统中成功表达纯化了GST-PB1-F2融合蛋白,为深入研究PB1-F2蛋白的功能奠定了基础。     

猪链球菌2型epf基因的原核表达及其蛋白纯化

为了克隆、表达SS2菌株轲基因片段,分析蛋白活性,根据GenBank SS2 epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,构建原核表达质粒pGEX4T-2-epf,在大肠杆菌中诱导带有GST标签的融合蛋白rEF-GST的表达;亲和层析法纯化融合蛋白rEF-GST,用凝血酶切除重组蛋白中的GST,获得纯化的EF抗原。经Westernblot鉴定,EF可与SS2多克隆抗血清发生特异性反应。     

猪流行性腹泻病毒重组M蛋白膜外区原核表达IPTG最佳诱导条件的确定

将猪流行性腹泻病毒编码M蛋白囊膜外区的基因片段（M’）亚克隆后，构建重组质粒pGEX-6p-M’并转化大肠杆菌以不同浓度IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明，在以浓度为0．3-0．5mmol／L的IPTG诱导6h条件下pGEX-6p-M’获得了最高效表达。     

PRRSV新疆株N基因原核表达条件的优化及蛋白纯化

[目的]获得重组表达质粒pGEX-6P-N在大肠杆菌BL21中高效表达,分析表达蛋白的免疫学活性及纯化后蛋白的浓度.[方法]通过优化诱导剂终浓度和诱导时间来实现融合蛋白的高效表达,使用BCA法测定蛋白浓度,利用Western blotting分析融合蛋白的免疫学活性.[结果]融合蛋白在37℃条件下,经终浓度为1.2 mmol/L的IPPG诱导表达4.5 h后获得了较高的表达水平.纯化后的融合蛋白经BCA法测定蛋白浓度达到0.587 mg/mL.Western blotting试验表明,GST-N蛋白能与抗PRRSV阳性血清发生特异性反应.[结论]为建立N特异性抗体的间接ELISA检测方法及PRRS诊断试剂盒的研制奠定了基础,为新疆PRRS的防控提供了理论支持.     

斑点叉尾鮰病毒ORF6基因的高效可溶表达及抗原性分析

利用GST融合基因表达系统表达GST-GP6融合蛋白,以质粒pMD19-T-ORF6为模板,扩增出ORF6基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2,将所构建的重组质粒pGEX-4T-2-ORF6转化E.coli ER2566,并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行10%SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果表明,大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-GP6融合蛋白相符,表达产物以可溶的形式存在。Western blot分析表明,融合蛋白能够与斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。     

小麦矮秆基因Rht3和赤霉酸不敏感基因Gai3与a—淀粉酶的表达

以小麦赤霉酸反应不敏感的Ｒｈｔ３矮秆基因两个近等基因系及其分离群体为材料,分析了Ｒｈｔ３、Ｇａｉ３与ａ－淀粉酶表达的相互关系。结果表明,Ｒｈｔ３、Ｇａｉ３能强烈地抑制萌发籽粒ａ－淀粉酶的表达,降低ａ－淀粉酶活性水平。高矮亲本间ａ－淀粉酶活性差异明显,矮扬３、矮苏３和扬麦３号、苏麦３号的ａ－淀粉酶ＯＤ值分别为０．０７１,０．０８０和０．０６３５,０．７２０。经Ｘ＾２测验,两群体中ａ－淀粉酶生高、中、     

猪pGH基因真核表达载体的构建及其表达

从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。     

性别决定基因Sry原核表达载体的构建和蛋白检测

动物的性别在畜牧业是一项很重要的经济性状，而哺乳动物的性别决定受睾丸决定基因Sry的启动，获得SRY蛋白并探索它与其他相关因子之间的相互关系对于深入了解该因子的作用机理和寻求高效经济的性别控制方法尤为重要。本研究以小鼠为实验材料，通过PCR、质粒重组、酶切和测序等方法构建小鼠Sry的原核表达载体，使用IPTG诱导蛋白表达、SDS-PAGE电泳和western blotting等方法检测重组表达载体的原核表达。PCR、酶切和测序结果一致显示成功地构建了原核表达载体pET-21b-Sry；使用anti-Sry和anti-His特异性抗体进行的western blotting实验结果验证了蛋白表达的正确性。本实验不仅实现了哺乳动物性别决定因子的Sry原核表达，而其还获得了具有生物活性的SRY蛋白，对于深入研究Sry及其他相关基因的相互作用奠定了实验基础。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建及表达

[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达

【目的】 研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】 以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】 (1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2 181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】 DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因植物表达载体的构建及瞬时表达

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体具有特异性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性的特点,被认为是肿瘤凋亡疗法较有希望的候选药物。植物生物反应器在药用蛋白质生产方面具备较大优势。构建了可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的植物表达载体,进行本氏烟(Nicotiana benthamiana)瞬时表达,并对目的蛋白的体外活性进行检测。结果显示,本氏烟叶片中目的蛋白平均表达量为68.60 pg/mg TSP;在浓度为200 pg/m L时,对NCI-H460细胞株的抑制率为28.75%。研究表明,经密码子优化的编码基因能够在受体植物中表达出有活性的目的蛋白,为开展目的基因的稳定转化工作奠定了基础。     

籽鹅FSH真核表达载体的构建及表达

为了构建真核表达载体pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β,并检测其在籽鹅颗粒细胞中的瞬时表达。利用PCR技术合成籽鹅FSH全基因后,构建促卵泡素α、β亚基真核表达载体,并转染籽鹅卵泡颗粒细胞。结果表明:基因片段已正确插入真核表达载体,同时在颗粒细胞中检测到pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β的融合蛋白表达。说明已构建真核表达载体pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β,并在颗粒细胞瞬时表达成功,为研究和开发生物制剂奠定基础。     

MBP-mCTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

为了构建鼠的CTCF与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并进行原核诱导表达及鉴定,以pMXs-3Flag-m CTCF为模板,PCR扩增得到mCTCF序列,目的基因片段EcoRI,SalI双酶切后连接到同样双酶切的pMal-C2G载体上,测序鉴定。将测序正确的质粒转化到E.coli BL21中,用IPTG诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE分离检测蛋白表达效果。经菌液PCR、测序鉴定、双酶切鉴定证明,得到的重组质粒pMal-C2G-mCTCF构建成功,且成功诱导出了MBP-mCTCF融合蛋白,最佳诱导条件为:10×10~(-4) mol/L IPTG浓度在37℃诱导6 h。     

小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达

【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。     

凋亡素融合基因原核表达载体的构建及可溶性表达

在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-22b-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达。软件分析结果表明表达蛋白占菌体蛋白的20%,上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地与所表达的蛋白带特异性结合。