成年兔睾丸支持细胞的分离纯化研究

本试验以5月龄公兔为试验动物,去除睾丸被膜及血管,分离出完整的曲精细管后用0．5％胰蛋白酶和0．1％胶原酶消化并进行低渗处理,将制成的细胞悬液植入25cm^2的培养瓶,于38．7℃、5％CO2条件下培养,结果表明：经1：3Hanks超纯水低渗处理后,离体支持细胞纯度和活率分别达到72．04％和84．5％,显著提高了离体支持细胞的获取量和活率。     

成年兔睾丸支持细胞的分离纯化研究

本试验以5月龄公兔为试验动物,去除睾丸被膜及血管,分离出完整的曲精细管后 用0．5％胰蛋白酶和0．1％胶原酶消化并进行低渗处理,将制成的细胞悬液植入25 cm2的培 养瓶,于38．7℃、5％CO2条件下培养,结果表明:经1:3Hanks超纯水低渗处理后,离体支持 细胞纯度和活率分别达到72．04％和84．5％,显著提高了离体支持细胞的获取量和活率。     

睾丸支持细胞的功能、分离纯化及鉴定研究进展

支持细胞对维持精子形成过程中的微环境起决定作用,它可以通过分泌功能、细胞间连接形成的血睾屏障功能以及吞噬功能等来促进精子的形成过程,其发育异常会导致不同程度的雄性生殖缺陷。基于支持细胞在雄性动物生殖过程中的作用,体外培养高纯度支持细胞可成为研究睾丸两大核心功能-精子发生和性激素分泌功能相关调节机制重要的细胞模型。此外,体外培养睾丸支持细胞也可作为生殖毒理学等新兴热点领域的细胞模型,为评估和研究环境因素对雄性生殖的影响提供便利。因此,作者系统地归纳、总结了目前关于动物支持细胞生物功能的研究及常用的体外分离纯化、培养及鉴定方法,以期为利用动物支持细胞开展雄性生殖领域的研究提供参考。     

小鼠睾丸支持细胞分离培养及生物学特性鉴定

为了揭示睾丸支持细胞在精子发生及睾丸免疫豁免中的生物学作用,采用胰蛋白酶、胶原酶分步消化法和1/3浓度的Hank′s低渗液、50mmol/L Tris-HC(l pH7.1)液分别低渗处理及油红O脂质染色法对16～22d的幼鼠睾丸进行分离、纯化和生物学特性鉴定。结果表明:分离、纯化后的睾丸支持细胞损伤少、活率高、睾丸支持细胞占培养细胞总数的90%以上;根据形态学观察及油红O脂质染色法鉴定,睾丸支持细胞的生长状态良好,细胞突起很多,核仁清晰,胞质中可见大小不等的红色空泡状脂质小滴。     

新生牛睾丸未成熟支持细胞的分离培养与鉴定

为了探究中国西门塔尔牛新生牛睾丸未成熟支持细胞的体外培养特性,为细胞水平研究与繁殖性状相关候选基因奠定基础.以新生牛曲细精管为试验材料,利用组合酶消化法将其解离成单细胞悬液,采用差速贴壁法纯化未成熟支持细胞后进行体外培养与鉴定.结果 表明:福尔根染色结果可见所分离的细胞具有明显的双极小体;RT-PCR检测结果显示,所分...     

蒙古马睾丸支持细胞的体外分离培养与鉴定

为研究一种简单快速分离蒙古马睾丸支持细胞并保证其活性的基本方法,本试验采集2岁蒙古马睾丸组织于低温环境下进行机械分离,将1~3 g睾丸组织剪碎,采用重力沉淀法去除游离的红细胞和间质细胞;使用0.1%胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶+EDTA逐步进行组织消化,并用含有10%胎牛血清的培养基进行细胞培养;在接种后采用差异贴壁法分离纯化支持细胞,使用Tris-HCl低渗法去除杂质细胞,并采用碱性磷酸酶（AKP）染色、HE染色、实时荧光定量PCR方法进行鉴定。结果显示,支持细胞贴壁性能较强,培养24 h后大多数细胞开始贴壁,细胞形状呈椭圆形;培养48 h后胞质增多,折光性变强;培养3~4 d细胞胞质展开紧密连接,此时细胞呈三角形,有明显的核仁,培养6~7 d细胞生长状态进入稳定期。实时荧光定量PCR结果显示,GATA4和GDNF基因在培养细胞中极显著表达（P<0.01）,AKP染色支持细胞呈阴性表达,表明分离培养的细胞确为支持细胞。本试验使用机械分离法与两步酶消化法处理组织,可快速高效地获得睾丸支持细胞,成功构建了蒙古马睾丸支持细胞体外培养方法。     

家兔睾丸间质细胞的分离纯化及原代培养

为了研究家兔睾丸间质细胞(Leydigcell,LC)的分离纯化程序及体外生长特点,试验采用4种不同消化程序对家兔睾丸组织进行消化,percoll梯度分离出兔LC,并进行体外培养。结果表明:经4℃保存和34℃孵育,0.5mg/mLⅠ型胶原酶消化40min获得的细胞数最多,经percoll梯度分离的细胞纯度达92%;34℃、5%CO2条件下细胞生长良好,呈现梭形和不规则形2种形状。     

小鼠睾丸支持细胞体外分离培养的研究

为了研究一种能快速、高效地分离、纯化小鼠睾丸支持细胞的方法,试验采用颈部脱臼的方法处死3周龄的小白鼠,取其睾丸并去除附属组织(血管、白膜脂肪等)后剪碎,用Ⅳ型胶原酶和胰蛋白酶分步消化制备细胞悬液进行培养,台盼蓝染色以鉴定细胞的活率;再对细胞悬液进行低渗溶液处理并利用支持细胞贴壁而其他细胞不贴壁的特性对其进行分离、纯化;最后对支持细胞采用H.E.和油红O染色的方法进行鉴定,观察其形态、结构和生长增殖情况。结果表明:该方法能够有效地分离、纯化以及培养小白鼠睾丸支持细胞。     

鸡胚睾丸支持细胞的传代培养与鉴定

以孵化18d的广西土鸡鸡胚为实验材料,采用两步酶消化法分离鸡胚睾丸支持细胞,置于37℃、5％C02的培养箱中培养,用低渗的磷酸缓冲液（PBS）处理进行纯化,并对原代和传代支持细胞进行了鉴定。结果显示,睾丸支持细胞生长良好,已传至第4代;经低渗处理,可去除绝大部分的生精细胞,获得的支持细胞纯度可达95％;鉴定结果显示,支持细胞为碱性磷酸酶（AKP）阴性;油红O染色显示,支持细胞胞质内舍有大量的脂肪滴,核内有双极小体;丫啶橙染色证明支持细胞的细胞质中富含RNA,细胞核内的DNA含量也较高;罗丹明123染色证明支持细胞含有丰富的线粒体。结论：经两步酶消化法以及低渗处理后能得到纯度较高的鸡胚睾丸支持细胞;37℃、5％CO2的培养条件适宜支持细胞的生长;AKP染色、油红O、丫啶橙和罗丹明123等方法简单易行,适用于鸡胚睾丸支持细胞的鉴定。     

小鼠睾丸支持细胞的分离培养及其影响因素

为了简化小鼠睾丸支持细胞的分离方法,提高支持细胞的获取量,试验取初生6 d的昆明白小鼠睾丸,去除白膜,剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化,制成细胞悬液并分装于25 cm2的培养瓶中,置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育48 h,取出后冲洗2次,换液并继续培养。结果表明:支持细胞数占培养细胞总数的90%以上。     

Isolation,Culture and Identification of Testis Sertoli Cells in Mongolian Horses in vitro

To study a simple and rapid separation of testis Sertoli cells in Mongolian horses and ensure their activity,the testis tissue of two-year-old Mongolian horses was mechanically isolated under a low temperature environment in this experiment,and 1-3 g of testis tissue was chopped,the free red blood cells and interstitial cells were removed by gravity precipitation method.0.1% collagenase Ⅳ and 0.25% trypsin-EDTA were used for tissue digestion, and cells were cultured in medium containing 10% fetal bovine serum.After inoculation,the purified Sertoli cells were isolated and purified by differential sticking method,and the impurity cells were removed by Tris-HCl infiltration method,and were identified by alkaline phosphatase (AKP) staining,HE staining and Real-time quantitative PCR.The results showed that most of the cells began to adhere to the wall after culture 24 h,and the shape of the cells was oval.After culture 48 h,the cytoplasm increased and the refraction became stronger.After culture 3-4 d,the cytoplasm of the cells expanded into tight junction.At this time,the cells were triangular with obvious nucleoli.After culture 6-7 d,the cells entered the stable phase.Real-time quantitative PCR results showed that the expression of GATA4 and GDNF genes were extremely significantly expressed in cultured cells (P<0.01).AKP staining supported the negative expression in Sertoli cells,indicating that the isolated cultured cells were indeed Sertoli cells.In this experiment,tissue was treated by mechanical separation and two-step enzyme digestion,and testicular support cells were obtained quickly and efficiently,the method of culturing Sertoli cells in Mongolian horses testis in vitro was successfully constructed.     

鸡甘露聚糖结合凝集素的分离纯化及初步鉴定

本研究采用CNBr活化的Sepharose 4B亲和柱进行亲和层析,从鸡血清中分离纯化甘露聚糖结合凝集素（MBL）,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）方法测定其分子质量和构型。电泳图谱显示,在分子质量为33ku-34ku处出现两条带,表明鸡MBL具有多聚体形式。研究结果为进一步深入研究禽类MBL分子的特性奠定了基础。     

犊牛睾丸支持细胞的分离与冷冻保存

以新生犊牛睾丸为实验对象,应用组合酶法进行支持细胞分离培养,并研究了冷冻保存后支持细胞的生长特性。结果表明:在细胞分离时,消化睾丸组织,分离曲细精管法所获得的细胞悬液中的有效细胞数高于组织剪碎法。支持细胞体外培养,4 h后开始贴壁,3~4 d铺满培养皿底壁,传代后细胞生长较快,2 d即可增殖一代。HE染色,胞质染色较淡,而细胞核染色较深,呈圆形或椭圆形位于细胞质中央或偏位,核仁明显。采用10%FBS+10%DMSO的DMEM液做冷冻液,对细胞进行冷冻保存时,支持细胞的复苏率在65%以上。解冻后的支持细胞体外培养,4h开始有细胞贴壁,24h后大部分细胞贴壁,3~4d铺满培养皿底壁。     

牦牛与犏牛睾丸支持细胞分离培养及生物学特性比较分析

旨在建立牦牛与犏牛睾丸支持细胞分离培养及鉴定方案,比较两种牛睾丸支持细胞的生物学特性.本研究分别采集24月龄的3头健康公牦牛与3头F1代公犏牛睾丸组织作为2个样品组,其中每组3个生物学重复,分别通过混合酶消化、差速贴壁和饥饿处理分离得到两种牛的睾丸支持细胞,采用DMEM高糖及DMEM/F12培养基培养睾丸支持细胞,筛选...     

大鼠表皮干细胞的分离及鉴定

在试验中采用组织块法分离培养大鼠表皮干细胞,观察所培养的细胞形态,免疫组织化学方法检测CK15、P63、α6-integrin表达情况并用α6-integrin标记表皮干细胞经流式细胞仪检测其标记率,同时对1~6代表皮干细胞在不同培养时间计数。结果表明,采用组织块法能分离得到大鼠表皮干细胞,且获得的细胞生长良好;干细胞标记物CK15、α6-integrin、P63呈阳性。经流式细胞仪检测得知,黏附细胞被α6-integrin标记的几率为80%,而未黏附细胞被α6-integrin标记的几率仅为2%,二者相差较大。