应用斑点ELISA技术检测副溶血弧菌

研究了应用斑点酶联免疫吸附试验(Dot-Enzym e L inked Immunosorbent Assay,Dot-ELISA)技术检测副溶血弧菌Vibrio parahaem olyticus的方法。根据棋盘试验,确定副溶血弧菌免疫血清最佳工作浓度为1∶200,酶标抗体最佳工作浓度为1∶100,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。用该方法检测时,副溶血弧菌呈阳性,哈维氏弧菌V.harveyi、嗜水气单胞菌Aerom onas hydrophila、河流弧菌Vf.luvialis biotype、溶藻弧菌V.alginolyticus、大肠杆菌Escherichia coli均呈阴性。斑点ELISA方法不仅具有快速、经济的特点,而且可用肉眼直接判定结果,适合在基层单位应用推广。     

鸡源黄病毒卵黄抗体间接ELISA检测方法的建立

为在检测产蛋鸡黄病毒抗体水平过程中减少应激,以鸡源黄病毒FQ-C1株为包被抗原,建立检测鸡源黄病毒卵黄抗体的间接ELISA方法.确定的优化条件是包被抗原浓度为5.7 ng·μL-1,卵黄抗体以1∶160倍稀释,羊抗鸡IgG酶标抗体以1∶3 200稀释.经特异性、敏感性检验表明该方法特异性强、敏感性高,适合于产蛋鸡免疫后的抗体检测.     

PCR衍生技术快速检测副溶血弧菌的研究进展

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是引发食物中毒的重要病原菌,因此,快速、准确地对食品中副溶血弧菌进行检测是预防该菌引起食物中毒的关键。综述了近年来国内外利用PCR衍生技术快速检测该菌的研究进展,为该菌检测方法的应用与开发提供一定的参考和理论依据。     

间接ELISA法检测贝氏隐孢子虫特异性IgY抗体的研究

应用蔗糖密度梯度离心法纯化贝氏隐孢子虫卵囊,冰浴超声波破碎、反复冻融卵囊,低温离心获得贝氏隐孢子虫卵囊蛋白质抗原.免疫产蛋鸡,6次免疫后获得高免特异性卵黄抗体IgY.制备辣根过氧化物酶(HRP)标记免抗鸡IgG,其最佳工作浓度为1:4 000～1:6 000,贝氏隐孢子虫卵囊抗原包被浓度8.15 mg·L-1,4℃包被过夜(≥10 h);1×106mg·L-1 BSA-PBST稀释卵黄,建立了检测抗贝氏隐孢子虫特异性卵黄抗体的间接ELISA方法.     

PCR衍生技术快速检测副溶血弧菌的研究进展

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是引发食物中毒的重要病原菌,因此,快速、准确地对食品中副溶血弧菌进行检测是预防该菌引起食物中毒的关键。综述了近年来国内外利用PCR衍生技术快速检测该菌的研究进展,为该菌检测方法的应用与开发提供一定的参考和理论依据。     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

采用超声裂解副猪嗜血杆菌分离株5型菌体上清作为包被抗原,初步建立副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法。通过棋盘滴定法筛选确定最佳反应条件:抗原包被浓度50mg/L,37℃作用2h后4℃过夜包被,血清的稀释度为1∶320,抗原抗体反应时间为50min,酶标二抗稀释度为1∶12 000,作用时间为30min,底物显色时间为15min。经特异性、敏感性和符合性试验检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性高,可用于副猪嗜血杆菌的检疫和流行病学调查。     

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的急性毒性研究

为研究耐热直接溶血毒素(TDH)对实验小鼠的急性毒性,经腹腔注射实验小鼠不同浓度梯度的TDH(42.0、19.5、9.1、4.2和1.9mg·kg~(-1)体重,对照组设为PBS),连续观察14d,记录各组小鼠的死亡情况及生理反应。实验终止时进行大体解剖,摘取心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏观测脏器指数,断尾采血并计数血细胞。结果表明,TDH对昆明种小鼠的半数致死量LD_(50)为11.0 mg·kg~(-1)体重,小鼠的死亡主要集中发生在注射TDH后的72 h内,并且伴随着腹泻现象。各组存活的实验小鼠在注射TDH后的第5天后,精神状态基本恢复,正常进食进水。各组小鼠脏器未见明显炎症反应,小鼠血液中红细胞与白细胞数量也未见统计学差异。TDH的毒性靶器官是心脏、肺、肾脏、脾脏、胃和肠。TDH对小鼠的半数致死量和毒性靶器官及病理学表现可为TDH的进一步实际应用及研究提供科学的依据和资料。     

副溶血弧菌在玻璃器皿上的粘附及去除

[目的]研究副溶血性弧菌在玻璃器皿上的粘附及去除技术.[方法]以栽玻片模拟厨房中的玻璃类和陶瓷类厨具,选用酒精、醋酸及乳酸链球菌素作为抑菌剂对人工污染粘附到载玻片上的副溶血性弧菌进行处理,通过观察副溶血性弧菌在栽玻片上的存活数和去除率考察3种抑菌剂及其协同抑菌作用.[结果]载玻片上粘附的副溶血性弧菌的活菌数经生理盐水和不同浓度的酒精、醋酸和乳酸菌链球菌素作用后均有一定程度的降低,抑菌剂组残留的活菌数（残留率）明显低于生理盐水对照组,各抑菌组的抑菌能力均随着抑菌剂浓度的增加而增强.协同抑菌试验结果表明,pH 4.0、35％酒精、1.0 g,/L乳酸链球菌素的组合能有效抑制副溶血性弧菌在玻片上的粘附,具有良好的协同效应.[结论]副溶血性弧菌在玻璃器皿上有一定的粘附力,但酒精、醋酸和乳酸菌链球菌素具有较好的除菌效果.     

广州市售水产品副溶血弧菌和溶藻弧菌的耐药性评估

[目的]研究广州市售水产品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的耐药性情况。[方法]采用Kirby-Bauer纸片扩散法检测从水产品中分离的87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌对水产养殖业中常用的18种抗生素的耐药情况。[结果]水产品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌均对万古霉素、克林霉素以及青霉素类抗生素有明显抗性,多重耐药比例达100%,溶藻弧菌的多重耐受现象较为突出。[结论]广州市售水产品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌具有多种抗生素抗性,且多重耐药情况突出。     

间接ELISA检测抗犬瘟热病毒抗体方法的建立

以大肠杆菌表达的犬瘟热病毒(CDV)重组核蛋白(GST-NP)经纯化后作为包被抗原,通过方阵ELISA滴定确定GST-NP的适宜包被浓度为1.31 μg·mL-1,并由此建立检测抗CDV抗体的间接ELISA方法.通过对已知抗CDV阳性血清及抗其他病毒血清的试验,表明所建立的间接ELISA可特异检测动物血清中的抗CDV抗体.另外,通过不同样品的重复试验以及不同批次的检测试验,证明该方法在用于检测CDV抗体时具有很好的重复性和稳定性.     

检测禽霍乱抗体间接ELISA法的建立

以方阵滴定法选择出最适ＥＬＩＳＡ反应条件,用系列稀释法测定２１份血清样品的禽霍乱抗体ＥＬＩＳＡ效价（ＥＴ）,并与相应血清样品１∶２００倍稀释的Ｐ／Ｎ值配对,作线性回归分析,得到回归方程ｙ＝２１９．６７３ａ－１８３．５７０（ｒ＝０．９４４）和标准曲线,从而建立起快速定量测定禽霍乱抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法——阳阴比值ＥＬＩＳＡ效价法（Ｐ／ＮＩ－ＥＴ法）。利用该法,血清样品只需作１∶２００倍稀释,测定其Ｐ／Ｎ值,通过回归方程（或标准曲线）即可求得ＥＴ．     

奶牛孕酮间接竞争ELISA检测方法的建立

[目的]为孕酮检测试剂盒的研制奠定基础。[方法]采用二环己基碳化二亚胺法制备检测抗原,建立了检测奶牛孕酮含量的间接竞争ELISA方法。[结果]检测奶牛孕酮的间接竞争ELISA的最佳反应条件确定为:最佳包被浓度为100 ng/ml,碳酸盐缓冲液的包被效果较好,以4℃过夜+37℃2 h佳,最佳封闭液为2%山羊血清,酶标抗体的工作浓度为0.13μg/ml。建立的标准曲线方程为y=-1.844 4x-0.140 1(R2=0.981 7),检测范围为0~20 ng/ml,最低检测限为0.58 ng/ml。该标准曲线的批内变异系数和批间变异系数分别为2.22%和2.37%。[结论]该研究建立了定量检测奶牛孕酮的间接竞争ELISA方法。     

LH抗体间接ELISA检测方法的建立

以高纯度的促黄体素（LH）作为包被抗原,建立了检测LH抗体的间接ELISA法,该法的最适抗原包被浓度为1μg/mL,最佳酶标山羊抗小鼠抗体稀释度为1∶1500.该法只与LH阳性小鼠血清呈现阳性反应,而与LH阴性小鼠血清和小鼠促卵泡素（FSH）阳性血清呈现阴性反应.结果表明,该法具有良好的特异性和重复性,可用于LH免疫后抗体水平检测.     

猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法的建立

实验通过纯化猪附红细胞体后免疫小鼠及家兔制备阳性血清,建立了猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法.实验结果表明,以鼠阳性血清1:200稀释后作为捕获抗体,4℃包被过夜,1%明胶溶液37℃封闭1 h,兔阳性血清1:400稀释后作为检测抗体,辣根过氧化物酶标羊抗兔Igc抗体h:8000稀释,37℃显色10min为最佳反应条件.同时进行特异性、敏感性、重复性实验.该方法对猪附红细胞体最低检出量为3.812μg·mL-1,具有良好的特异性、敏感性和重复性,有望作为群体检测方法.     

检测猪肺炎支原体抗体间接ELISA方法的建立

选用猪肺炎支原体Mhp J株培养物制备抗原,建立检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA(酶联免疫吸附)方法.结果显示,ELISA试验的最佳反应条件为:抗原包被浓度为1.5 μg/ml,待检血清的最佳稀释浓度1∶100,2%明胶作封闭液,抗原抗体最佳结合时间为90 min,酶标抗体1∶10 000(体积比)稀释,最佳作用时间为60 min.对136份样品检测结果表明,建立的猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法与美国IDEXX公司生产的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒检测的符合率达到83.8%,假阴性率8.8%,假阳性率1.5%.     

猪圆环病毒Ⅱ型抗体间接ELISA检测方法的建立

建立了检测猪圆环病毒2型血清抗体的间接ELISA方法,并初步应用于临床血清样品的检测.用PCR方法从PCV2 HBZX株中获得截短的核衣壳(capsid,Cap)基因,将该基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-Cap,将该重组质粒转化宿主菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3),用IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达,表达蛋白cap分子质量为42 ku,可与6×HIS抗体反应;KCl预染切胶纯化目的蛋白,以其为抗原建立检测PCV2感染猪血清抗体的间接ELISA方法.ELISA检测5份血清样品结果变异系数均小于10%.用该方法分别检测湖北、河南等地的91份临床血清样品,阳性率为25%～100%.上述结果表明,所制备的目的蛋白具有较高的纯度和良好的免疫原性,所建立的间接ELISA检测抗体方法,具有良好的重复性,初步临床试用效果良好.     

牛乳铁蛋白直接竞争ELISA检测法的建立

[目的]建立一种检测牛乳铁蛋白(LF)含量的竞争ELISA检测方法。[方法]制备鼠抗牛LF单克隆抗体,采用直接竞争ELISA测定酶标记物效价,建立牛LF的直接竞争ELISA检测方法。[结果]纯化后,制备的鼠抗牛LF单抗效价达1∶1 280 000,且鉴定为IgG1。该单抗对牛乳铁蛋白具有很强的特异性。制备酶标单抗的效价为1∶640 000。抗原包被物和酶标单抗的最适工作浓度分别为1.0μg/ml和1∶40 000。抗原用碳酸盐缓冲液(pH值为9.6)包被先在4℃过夜、再37℃放置2 h的效果最好。采用2%牛血清白蛋白作为封闭剂的效果最好。在31.25~1 000 ng/ml浓度范围内,牛乳铁蛋白的logit(B/B0)与牛乳铁蛋白浓度的对数值呈显著的线性关系,其回归方程为y=-1.899 1x+5.043 3(R2=0.987 3)。[结论]该研究为研制用于奶牛乳腺炎诊断的牛LF检测试剂盒奠定基础。     

犬腺病毒间接免疫荧光检测方法的建立

用犬腺病毒制作的抗原玻片,通过确定最佳一抗和荧光抗体浓度,特异性试验和敏感性试验,建立了犬腺病毒间接免疫荧光方法,可用于狐狸脑炎的诊断.     

罗非鱼无乳链球菌间接ELISA检测方法的建立

本文利用终浓度为0.5%(v/v)的甲醛在4℃条件下灭活24 h制备灭活的罗非鱼无乳链球菌,用其作为抗原对兔进行免疫制备兔抗无乳链球菌血清,以无乳链球菌抗兔血清作为一抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔Ig G作为酶标二抗,建立并优化了无乳链球菌的间接ELISA快速检测方法。此检测方法的抗原最适包被浓度为1×10~7 CFU/mL,一抗最适工作浓度为1∶100(v/v),二抗最适工作浓度为1∶2 000(v/v),最低检测限为1×10~4 CFU/mL。利用此法对发病的罗非鱼进行检测,阳性检出率为80%,与本试验选取的指示菌株均无交叉反应。