首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到20条相似文献,搜索用时 578 毫秒
1.
噬菌体肽库的构建及抗狂犬病病毒肽的筛选   总被引:1,自引:0,他引:1  
体外合成编码6肽的随机DNA片段以及用于随机。DNA片段扩增的1对PCR引物,经PCR扩增BglⅠ酶切扩增产物,得到编码6肽的随机DNA克隆片段,将随机DNA克隆片段与噬菌体表达载体(FUSE5)相连接,连接产物电转化MC1061宿主菌,经抗性和插入复活筛选,获得1.6×10^8个独立克隆。文库经PCR扩增、斑点杂交、序列测定等综合鉴定,结果表明已成功构建了噬菌体6肽表面表达文库。用生物素化的抗狂  相似文献   

2.
刘颖  王显国  张巨明  刘芳 《草业学报》2012,21(5):325-330
 采用正交试验设计,以山野豌豆叶片DNA 为模板,从Mg2+ 、dNTP、引物和TaqDNA 聚合酶4种因素3个水平,对山野豌豆SRAP-PCR 反应体系进行优化,并比较了不同浓度模板DNA 对扩增效果的影响,建立了山野豌豆的SRAP-PCR 最佳反应体系。结果表明,山野豌豆SRAP-PCR 最佳反应体系为:2μL10×PCRbuffer(不含Mg2+ )、30ng的模板DNA、引物2.0μmol/L、Mg2+ 2.0mmol/L、TaqDNA 聚合酶1.5U、dNTP0.2mmol/L,总体积为25μL。各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以引物浓度影响最大,dNTP 浓度的影响最小。运用该体系对3份山野豌豆种源进行验证,证明该体系稳定可靠,并从98对SRAP 引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的20对引物组合。这一体系的建立及多态性引物组合的筛选为SRAP分子标记技术进行山野豌豆分子遗传学研究奠定了基础。  相似文献   

3.
结缕草属植物SRAP-PCR体系的建立和优化   总被引:8,自引:2,他引:6  
以SDS法提取的结缕草属植物叶片DNA 为模板,分别采用单因子试验和正交设计试验2种方法,对影响结缕草属植物SRAP-PCR 的MG2+ 、dNTP、引物、TaqDNA 聚合酶和模板DNA 五个因素进行优化试验。单因子试验分别研究各因素在多水平条件下对SRAP-PCR 反应体系的影响,得到最佳反应条件。正交设计采用L16(45)方案,综合考虑各因素间的相互作用,通过直观分析法获得各影响因素的最佳反应水平。根据4对引物对6 份结缕草属植物材料扩增结果的验证比较,2种方法所获得的最佳反应体系存在一定的差异。通过综合比较和分析2种方法的优化体系扩增出的条带数、多态性条带数及多态性比率,最终建立了结缕草属植物SRAP-PCR 的最佳反应体系:MG2+2.00mmol/L、dNTP220μmol/L、引物0.20μmol/L、TaqDNA 聚合酶0.50U、模板DNA60ng、2μL10×buffer,总体积为20μL。这一优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术进行结缕草属植物遗传多样性、种质鉴定、遗传连锁图谱及亲缘关系分析等方面的研究提供了科学的依据。  相似文献   

4.
聚合酶链反应(PCR)鉴定猪肉方法的建立及应用   总被引:1,自引:0,他引:1  
依据猪小卫星DNA序列设计了1对引物,建立了PCR鉴定生、熟猪肉的方法。应用本方法特异地扩增出预期的猪307bp的DNA片段,其检测敏感度对生猪肉达38.6fgDNA,对熟猪肉和高压猪肉为0.375fg全基因组DNA。运用该引物仅可扩增生猪DNA的单一片段,而对马、牛、羊等12种动物肉的DNA扩增则呈阴性。应用本法对63份生、熟猪肉进行鉴定,正确率为100%,对各种样品检测,均可在6h内完成。  相似文献   

5.
牛Y染色体特异DNA序列的体外扩增   总被引:3,自引:0,他引:3  
本试验建立了用聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR)体外扩增牛Y染色体特异DNA序列的方法。在牛、山羊和绵羊Y染色体特异DNA同源序列高度保守区设计一对引物,两条引物均为20NT,对公牛Y染色体特异的307bp序列进行体外扩增。从屠宰的成年公牛、母牛肝提取DNA,用作PCR扩增的模板。PCR反应总体积为50μL,各成分含量为:25mmo1/LTris-HCI(pH8.2),25mmol/L(NH4)2SO4、2mmol/LMgCl2、0.1mg/mLgelatin、5%Formamide、lμg模板、引物各为25pmol、dNTP各为200μmol/L、DNA聚合酶2IU。反应在微机控制PCR仪上进行,采用92.5℃变性,55℃退火,72℃延伸,共35个循环。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳,用pGEM-7zf(+)Hae Ⅲ作分子量标准。电泳结果,公牛个体样品显示清晰可见的特异DNA扩增带,而母牛个体样品无扩增片段出现。扩增产物用PstⅠ酶解后出现3条区带,与预期结果一致。  相似文献   

6.
根据鸡传染性贫血病病毒(CAV)的基因结构,设计并合成一对限制扩增长度为0.68kb的PCR引物.直接对临床可疑病鸡的血清进行靶DNA的PCR扩增.在不同地区的3批样品中,有2批扩增出一二分子量接近0.7kb的单一特异性DNA片段.用限制酶BglⅡ消化PCR产物.可获得分子量分别为0.33kb和0.35kb两个DNA片段,其酶切位点与靶DNA的相吻合.将PCR扩增为阳性的病料接种6日龄SPF鸡胚,并取其18日龄胚肝和由接种鸡肛孵出的雏鸡的血清重新进行PCR扩增,结果均为阳性,而同期对照胚肝及雏鸡血清为阴性.此外还用胚胎时接种过病料的雏鸡肝、脾和胸腺等组织抽提液作抗原,建立了检测CAV血清抗体的ELISA方法.研究结果提示,用PCR直接对病鸡血清中CAVDNA的扩增以及CAV抗体的ELISA检测是快速和特异的.它为鸡传染性贫血病(CIA)的流行病学调查、实验室诊断、CAV毒株的分离和鉴定提供了必要的检测手段.  相似文献   

7.
猪生殖与呼吸综合征病毒ORF6片段的cDNA克隆及鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
根据已发表的PRRSV基因组序列,设计并合成了1对特异扩增ATCC VR-2332株的ORF6的基因的引物,以ATCC VR-2332基因组为模板,通过RT-PCR扩增出586bp的cDNA产物。将该cDNA片段经T-A连接插入pGEM-Teasy载体中,用重组质粒转化大肠埃希氏菌JM109,获得重组质粒转化菌。对重南粒DNA进行PCR及酶切鉴定,证明插入的DNA片段与PCR扩增的DNA片段大小相  相似文献   

8.
采用RT-PCR方法,以IBV S1全基因特异性引物分别从我国华东,华北,华中,华南,西北及东北等地的IBV流行株基因组中扩增出预期的1.7kb左右的DNA片段。PCR产物的HaeⅢ酶切分析及其与英国IBV S1全基因核酸探针的分子杂交证实所获6个IBV流行株的PCR产物为IBV S1基因。将此6个毒株的S1基因PCR产物分别进行5‘和3’端的BamHI和HindⅢ酶切识别位点的分子修饰之后插入到  相似文献   

9.
应用聚合酶链反应检测伪狂犬病病毒DNA   总被引:1,自引:0,他引:1  
选用标准的伪狂犬病病毒(PRV)闽A株,经BHK21细胞培养,提取PRVDNA作为摸板;合成1对20-mer寡核苷酸作为引物;选择扩增序列由262个碱基对组成的位于编码多糖蛋白gp50基因,用耐热的Taq-DNA聚合酶经30个循环以后,扩增的产物直接用凝胶电泳检测,并用标准分子量确定。结果表明:以PRVDNA作为模板进行扩增,有扩增产物生成,以同科的疱疹病毒DNA作为模板在相同的条件下进行PCR扩增,无扩增产物生成,说明PRVPCR扩增是特异的。PCR技术检测PRVDNA敏感度为28.5pg.PRVPCR技术的建立,为伪狂犬病诊断和流行病学研究提供了更敏感、可靠的手段。  相似文献   

10.
建立了检测鸡喉气管炎病毒(ILTV)的二温式聚合酶链反应(二温式PCR),根据已报道的ILTV TK基因的序列,设计并合成了1对引物,用二温式PCR对5株不同ILTV DNA进行扩增。该对引物对5株ILTV DNA均扩增出与预期大小相一致的647bp的扩增产物,而对新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、禽沙门氏菌、鸡毒霉形体和禽巴氏杆菌等6种禽病病原体的扩增,  相似文献   

11.
利用SSR、ISSR和RAPD技术构建苜蓿基因组DNA指纹图谱   总被引:45,自引:13,他引:45  
魏臻武 《草业学报》2004,13(3):62-67
在建立可靠的苜蓿基因组DNA提取分离和PCR扩增技术体系的基础上,筛选具有稳定多态性位点的RAPD、SSR和ISSR引物,建立苜蓿基因组DNA的SSR、ISSR和RAPD分子标记技术体系,并利用分子标记检测苜蓿品种(系)的DNA分子标记多态性,构建苜蓿品种的DNA指纹图谱.筛选出36个RAPD引物,8个SSR引物和12个ISSR随机引物,通过PCR扩增在55个国内外苜蓿品种(系)中获得了182个RAPD多态性位点和丰富的SSR和ISSR多态性位点,构建了55个苜蓿品种(系)的SSR、ISSR和RAPD指纹图谱.结果表明,不同苜蓿品种(系)的SSR多态性有较大差异;苜蓿品种ISSR指纹图谱多态性丰富,稳定性比RAPD强;可以通过2~3个引物鉴别我国主要苜蓿品种和引进品种,SSR和ISSR指纹图谱可以更好地用于苜蓿品种鉴定和遗传多样性分析.  相似文献   

12.
微卫星序列(SSR)因具有分布广、共显性遗传、稳定、多态性丰富等优点而被广泛应用于动植物遗传研究中。利用EcoRⅠ,MseⅠ2 种内切酶酶切蕨麻基因组,酶切片段与用生物素标记的探针(AG)15、(GT)15杂交,然后通过链霉亲和素磁珠富集、含有SSR片段的基因组片段被吸附,再经洗脱、PCR扩增、克隆和测序,完成微卫星序列的收集。共获得有效克隆236个,随机挑选其中80个进行测序,结果显示68条序列(85%)为唯一序列,挑选出其中40条含有SSR位点的序列,用引物设计软件Primer 5 成功设计出 40 对引物,经初步筛选,最终获得多态性丰富,可稳定扩增的SSR引物20对,扩增成功率达50%。对20对引物扩增结果做了初步分析,扩增出多态性位点共338个,平均每对引物扩增出17个,平均有效等位基因数(Ne)、多态性信息含量(PIC)、Nei’s 基因多样性指数(H)和Shannon’s 信息指数(I)平均值分别为1.2440、0.8996、0.1768和0.3078。20对SSR引物为蕨麻遗传变异研究提供了新的分子标记工具。  相似文献   

13.
为了建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和羊口疮病毒(ORFV)的多重PCR检测方法,针对GenBank中3种病毒的基因组序列,合成了3对引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了鉴别检测3种病毒的多重PCR方法。特异性试验表明,应用该方法可分别扩增出3种病毒对应的目的片段,对大肠埃希菌、沙门菌、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、Vero细胞、正常羊组织的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验表明,该方法最低检测量分别为30.46pg/μL的绵羊痘病毒、28.9pg/μL的山羊痘病毒和26.94pg/μL的羊口疮病毒基因组DNA;应用本方法对85份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单项PCR检测方法结果一致,说明该方法可以用于临床上SPPV、GTPV和ORFV的鉴别诊断。  相似文献   

14.
采用正交设计优化紫花苜蓿(Medicagosativa L.)SSR-PCR反应体系,从17对SSR引物中筛选出6对扩增产物具有稳定多态性的引物,检测第1代植株的基因多态性。结果表明:4个紫花苜蓿品种德福(Defi)、德宝(Derby)、阿尔刚金(Algonguin)、三得利(Sanditi)共检测到25个等位基因,每对引物检测出2~8个等位基因,平均为4.17个。结合植株较高、叶色较深、叶片较大、多叶4个表型突变指标,检测经过表型变异筛选的植株等位基因频率及每个位点的多态性信息量(PIC),PIC在0.2216~0.8328之间变化,平均为0.6366。分析多态基因植株与表型变异的相关性,根据检测结果初步确定了13株突变植株,为后继世代遗传变异的多代跟踪及选育奠定基础。  相似文献   

15.
结缕草属优良品系SSR指纹图谱的构建   总被引:14,自引:0,他引:14  
采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合快速银染检测,从45对Xgwm系列SSR引物中筛选出2对产物清晰、稳定的引物,建立了11个结缕草优良品系的DNA指纹图谱,并借鉴常规植物分类法,以品系的特征带为依据,从分子的角度将它们与生产上的主栽品种‘马尼拉’、‘青岛结缕草’和‘兰引3号’结缕草区分开来。最后利用统计软件SPSS 10.0通过欧氏平方距离法进行聚类分析,将14份参试材料分为3组。  相似文献   

16.
Here we describe an approach to genotyping D. nodosus, based on variation in the fimbrial subunit gene (fimA), which uses polymerase chain reaction (PCR) amplification and hybridisation to immobilised oligonucleotides (PCR/oligotyping).The variable region of D. nodosus fimA, amplified and labelled with digoxigenin (DIG) in a single multiplex PCR amplification, was hybridised to a panel of group- and type-specific poly-dT tailed oligonucleotides that were immobilised on a nylon membrane strip. A mixture of positive control poly-dT tailed oligonucleotides was also included on the membrane. After hybridisation the membrane was washed to a defined specificity, and DIG-labelled fragments hybridising were detected with nitroblue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (SCIP). The specificity of the oligonucleotides was verified by the lack of cross-reactivity with D. nodosus fimA sequences that had a single base difference. DNA from 14 footrot samples previously genotyped by PCR-SSCP/sequencing [Vet. Microbiol. 71 (2000) 113], was assayed using the PCR/oligotyping technique. All types of D. nodosus which had been detected previously with a PCR-SSCP/sequencing method were detected by this procedure. However, for three of the 14 footrot samples, PCR/oligotyping detected additional types of D. nodosus. Further PCR amplification using type-specific primers, confirmed that these types of the bacterium were present in the footrot samples. These results indicate that PCR/oligotyping is a specific, accurate, and useful tool for typing footrot samples. In combination with a rapid DNA extraction protocol, D. nodosus strains present in a footrot sample can be accurately identified in less than 2 days.  相似文献   

17.
应用多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒和桃拉病毒   总被引:5,自引:0,他引:5  
研究建立了一种可同时检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)和桃拉病毒(TSV)的多重聚合酶链式反应(多重PCR)技术。根据WSSV和TSV基因序列,设计合成了2对分别与WSSV和TSV某段基因序列互补的引物,用这2对引物对同一样品中的WSSV DNA和TSV RNA模板进行多重PCR扩增。结果均同时得到了2条特异的与实验设计相符的306bp(WSSV)和231bp(TSV)多重PCR扩增带,而对其他对虾病病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR技术能检出10pg的WSSV DNA和1pg的TSV RNA模板。  相似文献   

18.
根据鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株基因组的结构特点,设计合成了二对引物XZ1,XZ2和XZ45、XZ46,建立了一种同时检测鉴别MG野毒株和弱毒疫苗株的多重PCR技术。试验结果表明,用这两对引物对MG强毒株和弱毒疫苗侏进行多重PCR,强毒株只扩增出732bp一条带,而弱毒疫苗株则可同时扩增出732bp、524bp二条带,而对其他种类鸡支原体和其它禽病病原的扩增不出现任何条带,结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR最低能检出1Pg的MG强毒株和弱毒疫苗株的DNA模板。  相似文献   

19.
Foetal sex determination using polymerase chain reaction (PCR) in mammals is based on the amplification of gender‐specific foetal DNA sequences circulating in maternal blood. The bovine synepitheliochorial placenta does not allow a direct contact between the trophoblast and the maternal blood, resulting in difficult passage of foetal DNA and, consequently, its very small amounts in maternal bloodstream. Circulating cell‐free foetal DNA (ccffDNA) encompasses short nucleotide fragments (300–600 bp) in maternal circulation. The aim of this study was to assess this non‐invasive method in accurate prenatal sexing in early and late gestational periods in comparison with ultrasound diagnostics. As various DNA isolation and amplification methods were tested, their success in obtaining reliable results was evaluated. Two groups were tested, each consisting of 20 pregnant cows. Blood of a bull and a non‐pregnant heifer was the controls. Extraction of foetal DNA was accomplished by three different methods: using tubes with silicone membranes, a single‐tube extraction without silicone membranes and phenol–chloroform extraction. Following each extraction method, foetal DNA was amplified using PCR and real‐time PCR with both bAML and TSPY primers in a separate reaction. Positive results were obtained only after amplification of foetal DNA extracted with a single‐tube extraction kit. In comparison with ultrasound examination results and foetal gender recorded at birth, the sensitivity of the PCR test was 90% in Group I, but the technique failed to detect male foetuses in Group II. The real‐time PCR test sensitivity in Group I was 90% and in Group II 91.6%.  相似文献   

20.
应用多重PCR同时检测牛、羊源性成分   总被引:3,自引:0,他引:3  
我们选择了3对引物A,B,C.A可扩增大多数脊椎动物(哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类)细胞色素b基因上一个371 bp的区段,B可扩增位于牛mtDNAD-loop区段内的一个274 bp的区段,C可扩增羊mtDNA基因上一个199bp的区段.由于3对引物扩增的产物分别相差约100 bp左右,可通过琼脂糖凝胶电泳分离来并观察结果,建立了基于内对照的同时检测牛、羊源性成分的三重PCR方法.  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号