香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。     

香蕉果实MaGBSSI基因家族的克隆及表达分析

以"巴西"蕉(Musa acuminata L.AAA group cv.Brazilian)为试材,利用同源克隆法获得4个颗粒结合淀粉合成酶I(Granule-Bound Starch Synthase I,GBSSI)基因家族成员的cDNA全长,运用MEGA 5.05软件进行聚类分析,并通过quantitative real-time PCR(qPCR)技术检测MaGBSSI基因家族成员在香蕉果实不同发育时期及成熟阶段和不同组织中的表达情况。结果表明:香蕉4个MaGBSSI基因家族成员MaGBSSI-1、MaGBSSI-2、MaGBSSI-3、MaGBSSI-4的cDNA全长分别为1 851、1 851、675、1 845bp,登录号分别为KF512020、KF512021、KF512022、KF512023。聚类分析发现,香蕉MaGBSSI基因家族与其它植物GBSSI基因同源性达65%。qPCR分析发现,MaGBSSI-1、MaGBSSI-2、MaGBSSI-4在香蕉根、球茎、叶片和苞片等营养器官中明显上调表达,而MaGBSSI-3在花、果皮、果肉等生殖器官中表达量比较高,在根、球茎及叶片中几乎不表达。香蕉果实发育过程中,MaGBSSI-1、MaGBSSI-2、MaGBSSI-4在0~30d明显上调表达,而MaGBSSI-3在香蕉果实发育30~60d表达量比较高,在0~30d几乎不表达,且随着果实的成熟,MaGBSSI-3表达量逐渐下降。研究结果为阐明香蕉果实的直链淀粉生物合成及降解机制并对其进行表达调控奠定了基础。     

冬枣两个ACC氧化酶基因的cDNA克隆及其表达模式

 根据植物ACC氧化酶（ACO）家族的氨基酸和核苷酸保守区序列设计简并引物,采用3′RACE技术从半红期冬枣果实中分离了两个ACO同源基因片段,随后通过PCR技术进一步获得了两个包含完整开放阅读框（ORF）及3′端非编码区（UTR）序列的ACO基因的cDNA,即ZjACO1和ZjACO2。两个基因序列在GenBank中的登录号为EU216549和EU216550,其大小分别为1 115 bp和1 105 bp,编码蛋白大小分别为319个和321个氨基酸。ZjACO1和ZjACO2在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为79.4%和84.0%。Northern杂交结果表明,这两个基因在冬枣叶片中不表达,而在不同发育阶段果实中的表达具有明显差异。     

香蕉中一个新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及采后表达分析

利用抑制消减文库从香蕉中分离到一个cDNA片断,结合RACE技术获得该基因的全长序列。该全长cDNA共含1 285个碱基,通过Blastx同源性分析结果显示它与香蕉的一个S-adenosyl-L-methionine synthase(SAMS)基因(GenBank序列号为AF004317)具有82%的碱基同源性,编码的氨基酸顺序有93%同源性,但在cDNA的5’和3’非编码区同源性较低。设计特异引物对此基因进行RT-PCR分析表明,正常成熟的香蕉果实,采后当天表达量较高,随后略有降低,至采后12 d又达到一个相对较高值后迅速下降;高锰酸钾处理的果实,整个成熟期该基因均表现一个比较高的表达量;乙烯利处理的果实,采后表达量明显下降且处在一个比较稳定的水平。     

香蕉凝集素基因双启动子表达

为了获得香蕉果实特异表达的强启动子,利用PCR方法将2个凝集素(BanLec)基因启动子串联在一起,置换植物表达载体pBI121上的35S启动子,构建BanLec基因双启动子携带gus植物表达载体pBIL3,用基因枪转化香蕉叶片、根系和果实薄片,瞬时表达结果显示BanLec基因串连的双启动子依然表现为果实特异性表达,而且表达量明显高于BanLec基因单启动子及35S启动子,证明该串连的双启动子是一个在香蕉果实中特异表达且表达量较高的强启动子。     

桃MYB3基因的克隆及表达分析

本试验以桃抗寒性不同的3个品种毛桃、21世纪、优25-3的叶片、越冬的韧皮和花芽为试验材料,根据NCBI数据库中预测的桃MYB3的mRNA(GenBank登录号为XM007218080.2)序列设计一对引物,通过RT-PCR技术克隆得到一个长度2 268 bp的MYB3基因序列。生物信息学软件分析表明,其含有2个内含子,3个外显子,含有1个完整的开放阅读框长度为1 128bp,编码375个氨基酸,分子质量为41.931 kD,理论等电点为5.10,具有2个典型的SANT结构域,属于R2R3-MYB.遗传进化分析表明PpMYB3与乌梅(Prunus mume)的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,PpMYB3在桃的花芽和韧皮部均有表达,PpMYB3相对表达量与取材时期温度变化趋势相一致。本试验推测PpMYB3转录因子在桃抗寒方面起到负调节作用。     

黄瓜贝壳杉烯氧化酶基因CKO 的克隆及其表达分析

 以‘戴多星’黄瓜为试材,应用同源克隆和RACE技术从茎尖中得到赤霉素合成的关键酶--贝壳杉烯氧化酶（KO）基因cDNA全长序列,命名为CKO,GenBank登录号为JN792591,其长度为1 895 bp,开放阅读框（ORF）编码519个氨基酸,相对分子量为59.211 kD,等电点（PI）8.45。氨基酸同源性分析发现,CKO与苦瓜的KO同源性最高,达84%;序列结构分析表明,CKO属于细胞色素超家族P450系,具有细胞色素P450的血红素结构域FXXGXRXCXG和跨膜结构域。实时荧光定量分析表明,CKO在遮荫的徒长苗中表达量最高,是正常苗的5.18倍,在遮阴条件下喷施多效唑可降低期表达。     

香石竹ACC氧化酶基因的克隆及其正义反义表达载体的构建

利用在Genebank上已报道的香石竹ACC氧化酶(ACO)基因的CDNA序列设计特异引物,以香石竹品种'MASTER'的eDNA为模板进行PCR扩增,克隆香石竹ACC氧化酶(AC0)基因.测序结果显示,克隆基因的序列与报道序列完全一致.将克隆的ACC氧化酶(AC0)基因分别连接到植物表达载体PBI121启动子CaMV 35S的上游及下游,构建香石竹ACC氧化酶(Aco)基因的正义表达栽体PBI121-ACO及反义表达载体PBI121-anti ACO.经PCR鉴定,基因已成功构建到表达裁体上.为香石竹抗衰老基因工程育种奠定了基础.     

节瓜ACC合酶基因CqACS的克隆与表达分析

为分析ACC合酶与节瓜雌性之间的关系,以雌性自交系(A36)和普通雌雄同株自交系(SX)为材料,克隆得到节瓜ACC合酶(CqACS)基因,并与葫芦科中已知的ACC合酶基因进行同源序列比对分析、构建进化树;对A36幼苗叶片进行赤霉素(GA₃)处理后用qRT-PCR对CqACS基因进行表达分析,并统计赤霉素处理前后20节内的雌花率。结果表明,CqACS基因在雌性自交系A36中的长度为1?318 bp,普通雌雄同株自交系SX中长度为1?637 bp。经对比分析,SX比A36多了91、97、117 bp 3个片段,除此之外只有2个碱基的差别。同源序列比对发现,A36中的CqACS基因与西瓜中的Cit-ACS1基因同源性最高,为95.31%,与黄瓜中的Cs-ACS1基因同源性为91.13%;SX中的CqACS基因与西瓜中Cit-ACS1基因同源性为78.04%,与黄瓜中的Cs-ACS1基因同源性为76.06%。GA₃处理后,A36的平均雌花节率(20节位内)为45%,而对照为90%;qRT-PCR分析发现,与对照相比,CqACS基因在GA_3<...     

节瓜ACC 合酶基因CqACS 的克隆与表达分析

为分析ACC 合酶与节瓜雌性之间的关系，以雌性自交系（A36）和普通雌雄同株自交系（SX）为材料，克隆得 到节瓜ACC 合酶（CqACS）基因，并与葫芦科中已知的ACC 合酶基因进行同源序列比对分析、构建进化树；对A36 幼苗 叶片进行赤霉素（GA3）处理后用qRT-PCR 对CqACS 基因进行表达分析，并统计赤霉素处理前后20 节内的雌花率。结果 表明，CqACS 基因在雌性自交系A36 中的长度为1 318 bp，普通雌雄同株自交系SX 中长度为1 637 bp。经对比分析，SX 比A36 多了91、97、117 bp 3 个片段，除此之外只有2 个碱基的差别。同源序列比对发现，A36 中的CqACS 基因与西瓜中 的Cit-ACS1 基因同源性最高，为95.31%，与黄瓜中的Cs-ACS1 基因同源性为91.13%；SX 中的CqACS 基因与西瓜中Cit- ACS1 基因同源性为78.04%，与黄瓜中的Cs-ACS1 基因同源性为76.06%。GA3 处理后，A36 的平均雌花节率（20 节位内） 为45%，而对照为90%；qRT-PCR 分析发现，与对照相比，CqACS 基因在GA3 处理后的相对表达量显著上调，且在第3 次 处理后4 h 上调最大。     

牡丹ACC氧化酶基因的克隆与反义载体的构建

根据报道的牡丹ACC氧化酶基因(DQ337251)cDNA序列,设计一对特异引物,以牡丹品种"洛阳红"基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出牡丹ACC氧化酶基因的部分片段,并将其连接到pMD18-T载体上进行测序.结果表明,克隆的序列全长为467 bp,其中包括一个长度为157 bp的序列,推测它可能是一个内含子,其它序列与已报道序列同源性为98.2%;用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒和载体pBI 121酶切、连接,构建牡丹ACC氧化酶基因的反义表达载体.     

‘巨峰’葡萄细胞分裂素氧化酶基因CKX3的克隆与表达分析

结合同源克隆和RACE技术在‘巨峰’葡萄（Vitis labruscana Bailey × V. vinifera L.‘Kyoho’）中克隆了细胞分裂素氧化酶基因CKX3,分析了该基因的表达特性及其对细胞分裂素的响应。序列分析表明,该基因cDNA全长为2 049 bp（GenBank登录号：KP689597）,ORF（开放阅读框）为1 569 bp,编码522个氨基酸,具有FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合结构域和细胞分裂素结合结构域。该基因定位在葡萄的7号染色体上,具有4个内含子,5个外显子。氨基酸序列多重比对和系统进化树分析显示‘巨峰’葡萄CKX3与荷花NuCKX3亲缘关系最近,与毛果杨同源性较高。基因表达分析结果显示‘巨峰’葡萄CKX3主要在根部和花序中大量表达,其次是在卷须和果实中有较高的表达,在茎和叶中的表达量较低;在花序发育过程中,在盛花期前表达量较低,盛花期以及盛花后表达量增加。在6-BA处理葡萄叶片后,CKX3的表达与细胞分裂素氧化酶的活性都高于对照。     

香蕉GLP基因家族全基因组鉴定及表达分析

为揭示香蕉类萌发素蛋白(GLP)功能,对香蕉GLP基因家族(MaGLP)进行了全基因组鉴定,分析了基因结构、染色体分布和启动子顺式作用元件和转录因子结合位点(TFBS)分布情况以及编码蛋白的理化性质、保守基序、进化关系,同时基于转录组的结果研究它们在4℃和45℃处理的叶片、枯萎病菌FocTR4处理的根系以及自然成熟和乙烯催熟的不同成熟阶段的果实中的表达情况。结果显示:MaGLP家族共有44个成员,编码区CDS序列长度为567～2 103 bp,分布于除10号染色体外的所有染色体上。大部分GLP基因包含1～2个外显子,多数GLP具有信号肽且主要定位在胞外。进化树分析发现,MaGLP可分为8个亚家族,其中亚家族M为香蕉特有。顺式作用元件和TFBS预测结果显示,MaGLP启动子区存在多种植物激素和逆境胁迫相关响应元件以及7种TFBS。MaGLP成员在香蕉不同组织部位中的表达水平差异较大且受多种胁迫调控。其中MaGLP5-1和MaGLP9-8对各种处理均有响应,MaGLP1-2和MaGLP9-4受高温、低温胁迫抑制,而Ma GLP9-6受高温、低温胁迫诱导,MaGLP5-4受高温和FocTR4...     

茶树NADPH氧化酶基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

以茶树(Camellia sinensis)‘迎霜’为试验材料,采用同源克隆的方法,利用RACE和RT-PCR技术获得茶树NADPH氧化酶基因Cs RBOHA的c DNA全长(Gen Bank登录号:KJ782632)。该基因全长3 157 bp,开放阅读框2 769 bp,编码922个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白分子量为103.33 k D,理论等电点为9.28;C端序列较保守,N端序列保守性较低,与烟草和蓖麻的相似性达79%,进化关系最近;蛋白结构具有典型的家族特征。该蛋白分布于细胞质膜上,与预测结果一致。实时荧光定量PCR结果显示,该基因的表达存在组织特异性,并且在低温(4℃)、高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、ABA(200 mg·L-1)和干旱(10%PEG 6000)条件下出现不同程度的上调。     

黄瓜果实弯曲相关基因Cs14-3-3 的克隆及表达分析

 以黄瓜（Cucumis sativus L.）果实易发生弯曲的品种‘长春密刺’为试验材料,采用RT-PCR 技术从果皮中分离并克隆了14-3-3 蛋白基因,并将此基因命名为Cs14-3-3。Cs14-3-3 基因cDNA 全 长792 bp,编码263 个氨基酸,分子量29 589.287 Da,等电点为4.585。生物信息学分析表明此基因含有 14-3-3 蛋白基因的典型结构域,与其他物种14-3-3 蛋白基因核苷酸序列同源性达到75%以上,编码的氨 基酸序列同源性达到85%以上,属于14-3-3 蛋白基因家族。同时,采用实时荧光定量PCR 方法对顺直果 实和弯曲果实腹部及脊部在果实开花的2、4、6、8、10、12 d 的基因表达量进行了研究。结果显示,在 果实发育各个时期,Cs14-3-3 的表达量均为在弯曲果实腹部 > 顺直果实 > 弯曲果实脊部的表达量;在 各个部位,Cs14-3-3 在果实开花2 d 的表达量明显高于开花后其他时期。试验结果表明,Cs14-3-3 基因为 黄瓜果实弯曲相关基因,在黄瓜果实开花早期发育过程中起重要作用。     

砧木南瓜硅转运蛋白基因CmLsi3的克隆与表达分析

以用于黄瓜嫁接的砧木南瓜‘云南黑籽南瓜’（Cucurbita ficifolia,去蜡粉能力弱）和‘黄诚根2号’（C. moschata,去蜡粉能力强）为试材,采用同源克隆与RACE相结合的方法克隆到硅转运蛋白基因cDNA全长,命名为CmLsi3（GenBank登录号分别为KM203110和KM359142）。两种砧木南瓜CmLsi3基因cDNA全长为1 206 bp,开放阅读框为795 bp,编码264个氨基酸,两者仅有4个位点的氨基酸不同,但与黄瓜、玉米、大麦等作物硅转运蛋白氨基酸序列同源性均在50%以上。CmLsi3蛋白含有2个NPA模体、6个跨膜结构域以及1个由Gly（G）、Ser（S）、Gly（G）和Arg（R）组成的ar/R选择性过滤器,属于水通道蛋白NIPⅢ亚家族。实时荧光定量分析表明,CmLsi3基因在砧木南瓜根、茎、叶中均有表达,且‘云南黑籽南瓜’各器官CmLsi3基因的表达水平高于‘黄诚根2号’。     

香蕉线条病毒衣壳蛋白功能域基因的原核表达及抗血清制备

 制备香蕉线条病毒广东分离物（BSV-GD）的抗血清,可为BSV-GD 的快速检测和进一步研 究BSV 编码蛋白的功能提供条件。通过常规分子生物学方法,克隆了BSV-GD 衣壳蛋白（Coat protein, CP）功能域基因,构建了该基因的原核表达载体pET28b-CP,并诱导表达了大小约为46.5 kD 的融合蛋 白His-CP。可溶性分析表明该融合蛋白以包涵体形式存在。利用His 标签纯化试剂盒对目的蛋白进行纯 化、回收,获得了高纯度的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫健康大耳白兔,成功制备了BSV-GD CP 功能域基因编码蛋白的兔抗血清。Western-blotting 分析表明该抗血清具有很强的特异性,间接ELISA 法检测抗血清效价达204 800 倍以上,对植物材料的合适检测浓度为1︰1 600 ~ 1︰6 400。