硅对水稻生长、白叶枯病抗性及病程相关蛋白活性的影响

【目的】研究硅对水稻生长及病程相关蛋白活性的影响,进一步明确硅与水稻白叶枯病抗性的关系。【方法】以感白叶枯病的水稻品种日本晴（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）为材料,在水培条件下,研究接种白叶枯病菌、施硅对水稻干物质累积的影响;接种病菌条件下,施硅与否对水稻叶片关键酶活性的影响及其与水稻白叶枯病抗性的关系。【结果】水稻接种白叶枯病菌后,植株地下部和地上部干物重均显著降低,但施硅处理,植株生物量及硅含量均显著升高。施硅处理水稻白叶枯病病情指数显著降低,与对照相比降低11.83%-52.12%,对白叶枯病的相对防御效果达16.55%-75.82%。叶片感染白叶枯病菌后,β-1, 3-葡聚糖酶活性和几丁质外切酶、内切酶活性均快速上升。β-1, 3-葡聚糖酶活性在感染白叶枯病菌的8 d内,施硅处理显著高于不施硅处理,接种后第8天达到最大值。整个试验过程中,加硅处理的水稻植株,叶片中几丁质外切酶、内切酶活性明显增加。【结论】施硅能促进水稻的生长,提高病程相关蛋白β-1, 3-葡聚糖酶和几丁质外切酶及内切酶的活性,降低病情指数,显著缓解白叶枯病的危害,达到显著的防治效果。     

水稻抗病相关基因的分离克隆和功能鉴定

水稻白叶枯病和稻瘟病分别是由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起,是世界水稻生产中的两大重要病害,造成的损失巨大.通过改良水稻自身防御体系来控制病害,是一种既经济义绿色的方法.鉴定水稻抗病相关基因,研究水稻抗病机理对改良水稻有着重要的理论意义和应用前景.     

利用MAS技术培育水稻多抗、优质强恢复系桂恢663

【目的】培育新的兼抗稻瘟病、白叶枯病和细菌性条斑病,且米质较优的水稻强恢复系,为选育抗病、高产、优质的杂交稻组合提供良好的亲本材料。【方法】以抗稻瘟病品种合丰占为母本,与抗白叶枯病品系粤泰占杂交,通过分子标记辅助选择(MAS),获得多个抗病基因聚合的优良单株,再经过多代自交选育,并进行田间抗性及米质鉴定、农艺性状考察及恢复力测试。【结果】培育出聚合了抗稻瘟病基因Pi-ta、Pib、Pi54和抗白叶枯病兼抗细条病基因xa5的多抗、优质强恢复系桂恢663。桂恢663对白叶枯Ⅳ型菌和强毒Ⅴ型菌表现为抗,对广西细条病优势菌株JZ-8表现为抗,对14个稻瘟病菌株,有12个达到1级抗性。桂恢663除直链淀粉含量偏低外,其余6个主要米质指标均达到国标2级标准,其与丰田1A所配抗病、高产、优质组合丰田优663通过广西品种审定。桂恢663和丰田优663谷粒具有香味。【结论】桂恢663兼抗稻瘟病、白叶枯病和细条病,且恢复力强、米质较优具有香味,是组配抗病、高产、优质杂交组合的优良亲本,同时为水稻提供重要遗传基础材料。     

水稻早衰突变体w14的鉴定和病程相关基因表达分析

【目的】叶片早衰影响水稻的产量和品质,早衰突变体是研究水稻衰老机制的良好载体,鉴定、分析早衰突变体的表型特征,有助于了解突变体的遗传规律,为相关基因的克隆和功能研究奠定基础。【方法】人工接种鉴定了早衰突变体w14的稻瘟病和水稻白叶枯病抗性,同时通过对离体叶片的黑暗诱导和叶绿素含量测定,鉴定了突变体w14的早衰表型;再分别对早衰突变体w14和野生型粳稻品种云引(简称‘YY’)中水稻早衰相关基因和病程相关基因的表达进行分析,研究早衰突变体w14的早衰类型及与野生型在防御系统上的差异。【结果】黑暗诱导处理24 h后,突变体w14的叶绿素含量显著低于野生型YY(P0.05)。黑暗诱导处理48 h以上,突变体w14的叶绿素含量极显著低于野生型YY(P0.01)。突变体w14中衰老相关基因SGR、 Osh36、 Osh69、 PAO、 NYC3和RCCR1的表达均显著高于野生型YY。分别接种水稻白叶枯和稻瘟病后,突变体w14均表现为比野生型YY更感病,且病程相关基因PR1a、PR4、Cth1、PR1b、PBZ1、PR3等的表达在突变体中显著上调。【结论】突变体w14具有典型的衰老和感稻瘟病、水稻白叶枯病的表型,与野生型相比,在突变体中与病程相关基因的表达发生了显著改变,即突变体防御系统的改变导致其出现感病的表型。     

两种黄单胞病菌诱导水稻一氧化氮产生和防卫基因表达的比较研究

 【目的】阐明在不同黄单胞病菌诱导的水稻过敏性细胞死亡(HCD)中的一氧化氮(NO)信号途径及其作用机制。【方法】比较分析了在水稻细胞－番茄斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)不亲和互作、水稻－白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae, Xoo)亲和互作中NO的发生以及NO对水稻防卫基因诱导表达的影响。【结果】Xcv不仅诱导了NO的迸发、NOS活性及其NO合成相关基因(nos和nr)的表达，而且诱导了防卫基因(苯丙氨酸解氨酶基因pal、过氧化物酶基因pox和谷胱苷肽转硫酶基因gst)的表达；Xoo不诱导NO的迸发，抑制了NOS的活性、NO合成相关基因和防卫基因的表达；NO清除剂PTIO和Xoo显著地抑制了Xcv 对防卫基因表达的诱导作用。【结论】Xcv通过NO信号途径诱导了水稻防卫基因的表达和HCD；Xoo 通过NO抑制或解毒机制抑制了由NO介导的防卫基因的表达及其HCD的发生。     

荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因克隆、原核表达及其抗菌活性分析

 【目的】实现荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组BNBD12的抗菌活性。【方法】RT－PCR扩增荷斯坦牛中性粒细胞BNBD12基因,序列分析后人工合成了适于在大肠杆菌中表达的BNBD12成熟肽,构建原核表达载体pET32a(+)/BNBD12,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。通过琼脂扩散法分别确定重组蛋白对牛源乳腺炎主要致病菌革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌效果,应用扫描电镜观察重组蛋白的杀菌效应。【结果】测序结果表明扩增片段长度为180 bp,可编码含60个氨基酸的成熟蛋白。SDS－PAGE和Western blotting分析显示人工合成的BNBD12的成熟肽基因以融合蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的21.4%;纯化的重组蛋白0.05 mg?mL-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显抑菌效果;扫描电镜观察发现重组蛋白作用后可引起病原菌内容物外泄而死亡。【结论】成功表达了荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素12,该重组蛋白既可作用于革兰氏阳性菌又可作用于革兰氏阴性菌,显示出较好的临床应用前景。     

鹅β-防御素10基因的分离、鉴定与表达

【目的】从鹅的组织中克隆鹅β-防御素10（avian β-defensin 10,AvBD10）基因,通过大肠杆菌进行原核表达,检测重组鹅AvBD10蛋白的生物学特性。【方法】采用RT-PCR方法,从鹅的肾脏组织中扩增鹅AvBD10基因。根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建系统进化树,进行遗传进化分析;并应用荧光定量的方法对该基因的组织表达水平进行鉴定。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1 上进行原核表达,并对该重组蛋白进行纯化,测定体外生物学活性。【结果】从鹅肾脏组织中克隆出了鹅AvBD10基因,该基因的cDNA大小为207 bp,编码68个氨基酸。经遗传进化分析表明,该基因推导的氨基酸序列与鸭AvBD10的同源性最高,达92.7%。通过对重组蛋白抗菌活性的检测发现,该蛋白对12种致病性细菌均具有较强抑菌作用,但在高盐离子浓度下活性减弱。并且重组蛋白不具有溶血的特性。【结论】成功克隆并表达了鹅AvBD10基因,原核表达产物具有广谱的抗菌活性且不具有溶血特性。     

牦牛β-防御素5基因的原核表达及表达产物的抑菌活性

【目的】克隆与表达牦牛β-防御素5(BNBD5)基因,检测其重组蛋白的体外抗菌活性。【方法】采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增BNBD5基因成熟肽编码区,根据已发现的哺乳动物β-防御素5和部分禽β-防御素5的序列构建遗传进化树。将BNBD5基因亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET32a-BNBD5。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG于37℃进行诱导表达,SDSPAGE检测融合蛋白的表达情况,并对该重组蛋白进行纯化,测定其体外抑菌活性。【结果】克隆得到了BNBD5基因成熟肽编码片段,其长度为138bp,编码45个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因序列与黄牛的mRNA同源性最高,可达到86.2%。经IPTG诱导,获得了分子质量为25ku的牦牛β防御素-5成熟肽融合蛋白。琼脂糖扩散结果表明,0.08mg/mL的纯化蛋白对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有抗菌作用。【结论】牦牛BNBD5成熟肽在大肠杆菌中得到了成功表达,其产物对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均有抗性。     

水稻对白叶枯病菌抗性相关蛋白的又向电泳分析

从寄主 -病原菌相互作用的角度来看 ,植物对病原菌的抗病反应又叫非亲和性反应 ,是寄主中的抗病基因与病原菌中对应的无毒基因互作 ,诱导寄主中有关防卫基因迅速协调表达的结果〔2 ,5〕。水稻白叶枯病 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)是影响世界粮食生产的重要病害之一〔7〕。目前从水稻种质中已经系统鉴定了近 2 0个抗病基因 ,并成功地克隆了 Xa2 1抗病基因〔9〕;从病原菌中已经系统鉴定了多个生理小种〔8〕或致病型〔1〕,并成功地诱导了一些无毒基因突变体和克隆了一些无毒基因〔4,6〕。但迄今对水稻 -水稻白叶枯病菌互作分子机理的了解…     

不同水稻品种(系)对白叶枯病的抗性分析

【目的】白叶枯病是水稻上重要的细菌性病害,本文检测了不同水稻品种(系)对主要白叶枯病菌的抗性情况。【方法】选择中国流行的9个白叶枯病菌株及菲律宾的强毒性广谱致病菌株PXO99,利用剪叶法对收集的64个水稻品种(系)进行抗性分析。【结果】生理小种YN24、PXO99、YN1致病力最强,致病率分别达到了95.31%、95.31%、92.19%,致病力最弱的生理小种是YN18,致病率只有3.23%;水稻品种(系)武21621、A130、圣稻740对10个生理小种都表现抗病,C418、K18对10个生理小种都表现感病,其它品种(系)对10个生理小种抗性表现不一。同时,PCR分析表明对10个菌株表现抗病的水稻品种圣稻740可能含有新的抗病基因,是一个潜在的抗病资源。【结论】这些研究结果对指导水稻白叶枯病抗性育种工作具有参考价值。     

葡萄扦插苗立枯病的病原鉴定及其药剂防治

[目的]查明温室大棚中葡萄扦插苗大量死亡的病原及其防治的有效药剂.[方法]通过常规分离培养、形态学鉴定、致病性测定、细胞核染色等方法鉴定其病原,通过室内药剂筛选有效药剂.[结果]造成葡萄扦插苗死亡的主要致病菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani),品种间发病有明显差异,高墨品种最为感病.药剂筛选证明:甲基立枯磷和五氯硝基苯对病菌的抑制效果良好.[结论]温室大棚中葡萄扦插苗死亡的主要病原为立枯丝核菌,应参照立枯病的方法进行防治,所用药剂可选用甲基立枯磷和五氯硝基苯等.     

拮抗细菌Bacillus subtilis A30对水稻病原菌的抑制作用

由杭州郊区水稻叶围分离得到ＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＡ３０菌株，平板检测表明它对Ｘａｎ－ｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ和Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ等多种水稻病原真菌、病原细菌均有很好的拮抗作用．以水稻白叶枯病、水稻纹枯病为代表进行小区试验，结果表明，Ａ３０菌株的防病效果分别为５８．１％和３９．０％．Ａ３０菌株的培养去菌液经７０％饱和度（ＮＨ４）２ＳＯ４处理，拮抗物可被（ＮＨ４）２ＳＯ４沉淀，其拮抗粗提液经Ｄｉｏｌ１５０及ｐｒｏＲＰＣＨＲ５／１０等色谱柱分离得到两种对Ｘ．ｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ的拮抗峰和两种对Ｒ．ｓｏｌａｎｉ的拮抗峰．     

抑制水稻纹枯病菌的植物筛选

以水稻纹枯病菌为供试菌,采用菌丝生长速率法测定了27科37种植物甲醇提取物的离体抑菌活性,发现羊耳菊全草对水稻纹枯病菌的抑菌作用最强,其茎和叶2个不同部位的甲醇提取物对水稻纹枯病菌的抑菌中浓度分别为1.19×103和4.08×103mg/L.以羊耳菊茎秆提取物对离体水稻叶片纹枯病进行了防效试验,当其浓度为10 × 103 mg/L时,先喷药后接种的预防效果为100％,先接种后喷药的治疗效果为92.38％.研究结果初步证实,羊耳菊含有强烈抑制水稻纹枯病菌的抑菌物质.     

哈茨木霉几丁质酶基因提高水稻抗病性研究

 以农杆菌介导法将木霉内切几丁质酶基因ThEn－42导入粳稻台北－309和农虎6号中。PCR检测表示ThEn－42己整合入水稻基因组中。在温室中进行的抗病性检测结果表明：T₀代转基因植株对纹枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn）的抗性得到了明显的提高。T₀代转基因植株的离体叶片也表现出对纹枯病菌的抗性。     

东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST的表达、纯化及抑菌活性分析

  【目的】利用毕赤酵母菌真核表达系统重组表达东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST,分析评价dybowskin-1ST的抑菌活性。【方法】采用TRIzol法提取蛙皮总RNA,经RT-PCR扩增获得抗菌肽dybowskin-1ST基因,将目的基因克隆到毕赤酵母菌分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-1ST。经电转化将pPIC9K-1ST转入到毕赤酵母菌GS115中,获得高效表达dybowskin-1ST的重组菌株。以甲醇诱导重组菌株,上清液经SDS-PAGE检测表明有目的蛋白dybowskin-1ST分泌表达。目的蛋白经Ni-agarose色谱柱分离纯化后,对大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肠炎沙门氏菌和蜡状芽孢杆菌进行抑菌活性分析。【结果】成功构建了东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST的毕赤酵母真核表达系统,且dybowskin-1ST对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有良好的抑菌效果。【结论】东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST具有良好的广谱抗菌活性和潜在的研发价值。     

抗蔓枯病甜瓜突变体edr2抗病现象的初步研究

 【目的】蔓枯病常引起甜瓜毁灭性的损失,研究甜瓜与蔓枯病菌互作的功能基因对选育抗蔓枯病的甜瓜品种是非常重要的。【方法】采用农杆菌侵染子叶外植体的方法产生T-DNA插入的甜瓜突变体,人工气候箱内离体和大棚内幼苗接种蔓枯病菌,筛选蔓枯病抗性增强的突变体株系,并且初步研究该突变体的抗病机制。【结果】一个蔓枯病抗性明显增强的突变体,命名为edr2,该突变体是T-DNA单拷贝插入甜瓜染色体引起的,edr2的蔓枯病抗性和标记基因卡那霉素抗性基因共分离。蔓枯病菌在突变体甜瓜edr2上的侵染过程与在野生型甜瓜上相比,分生孢子萌发率降低、芽管的伸长和菌丝的生长较迟缓。蔓枯病菌的侵染能引起edr2突变体发生细胞程序性死亡,但是不引起野生型甜瓜的细胞发生程序性死亡。【结论】edr2突变体抗性增强,不但抑制病菌在植株体内的生长,并且诱导自身的抗性。本研究为选育抗蔓枯病的甜瓜品种提供了新的思路,为挖掘甜瓜－蔓枯病菌互作的基因提供支持。     

10种常用杀菌剂对水稻纹枯病菌的敏感性及其协同作用

【目的】筛选出对水稻纹枯病菌具有较好协同作用的药剂组合,为田间防治水稻纹枯病和开发增效组合制剂提供理论依据。【方法】以水稻纹枯病菌为材料,采用菌丝生长速率法测定10种常用杀菌剂原药（包括嘧菌酯、啶氧菌酯和吡唑醚菌酯等8种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂,丙环唑和苯醚甲环唑2种三唑类杀菌剂）对水稻纹枯病菌的毒力,及丙环唑·肟菌酯组合对水稻纹枯病菌的协同作用;采用电导率法、可溶性蛋白试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒和过氧化物酶（POD）试剂盒等评价杀菌剂组合对水稻纹枯病菌生理生化特性的影响。2019年8月进行田间试验,评价250 g/L丙环唑EC、50%肟菌酯WDG及组合（250 g/L丙环唑EC与50%肟菌酯WDG有效质量比1:5）对水稻纹枯病的田间防治效果。【结果】10种杀菌剂原药对水稻纹枯病菌均有较高的毒力,EC₅₀为0.20～1.61 μg/mL,除唑菌酯和醚菌酯对纹枯病菌的毒力相对较弱外,其余8种杀菌剂对纹枯病菌菌丝生长均具有较好的抑制作用,EC₅₀均小于1.00 μg/mL,以吡唑醚菌酯的毒力作用最强,EC₅₀为0.20 μg/mL。丙环唑原药与肟菌酯原药按有效质量比1:10、1:5和5:1组合时对水稻纹枯病菌均具有较好的协同作用,其中以1:5组合时协同作用较明显,EC₅₀为0.24 μg/mL,共毒系数（CTC）为393.41;用该组合处理水稻纹枯病菌后,能提高病菌细胞膜的通透性,明显抑制蛋白的合成,降低SOD和POD活性。田间喷施250 g/L丙环唑EC与50%肟菌酯WDG组合后21 d,对水稻纹枯病的田间防治效果达94.08%,高于单剂250 g/L丙环唑EC（88.79%）和50%肟菌酯WDG（92.72%）处理。【结论】丙环唑·肟菌酯对水稻纹枯病菌具有较好的协同作用,对水稻纹枯病具有较好的防治效果,且可极大减少药剂使用量,具有开发成水稻纹枯病增效组合制剂的潜力。     

从稻种上筛选拮抗细菌防治水稻纹枯病的研究

从 1 3个水稻品种上获得 2 83个细菌分离物 ,其中 2 9个菌株对水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)产生了拮抗作用 ,占总菌株数的 1 0 .2 5 % ,8个菌株对水稻紫鞘病产生了拮抗作用 ,占总菌株数的 2 .83 % ,而没有菌株对水稻恶苗病菌 (Fusariummoniliforme)产生拮抗作用 ;经离体平板拮抗作用的测定、离体纹枯病病斑面积的抑制和植物生长促进试验 ,筛选出两个有潜在价值的菌株 ,这两个菌株经鉴定均为芽孢杆菌 (Bacillussp.)。     

水稻病害生防细菌的筛选及其生物活性测定

从健康水稻植株体表筛选对稻瘟病等水稻主要病害有益的生防细菌 ,在室内分离到对稻瘟病等病菌菌丝具有很强抑制能力的细菌菌落 2 7株 ,经室外试验测定 ,有 9个细菌菌落对稻瘟病、纹枯病等具有一定的防治作用。其中 ,G_0 5的防治效果最佳 ,叶瘟、穗颈瘟防效分别为 5 0 8%和 4 4 7% ,纹枯病的防效达到 4 6 1% ,是一个非常有应用前景的菌株     

不同遗传背景籼稻Xa23基因品系的白叶枯病抗性筛选和评价

【目的】系统比较分析含Xa23基因的籼稻品系白叶枯病抗性,为白叶枯病抗性育种及水稻白叶枯病防治等提供种子资源,同时为白叶枯病分子抗性育种提供参考。【方法】以14种遗传背景不同且含有Xa23基因的81份籼稻品系为材料,孕穗期采用剪叶接种法接种7种南方稻区白叶枯病生理小种代表菌株（FuJ、YN24、HNA1-4、GDA2、PXO86、GD1358和PXO99）,接种20 d左右当参试材料的病情趋于稳定时,量取病斑长度,鉴定参试材料的抗病性。【结果】供试材料对7株白叶枯病菌菌株的抗感分析结果显示,81份品系中有74份品系对7株白叶枯病菌菌株均为抗病,其中35份品系对所有菌株为高抗;含Xa23基因品系对7株白叶枯病菌菌株的抗性频率大小为:PXO86和YN24（100.0%）>GD1358和HNA1-4（98.8%）>PXO99（96.3%）>GDA2（95.1%）>FuJ（93.8%）;同一遗传背景品系对7株白叶枯病菌菌株病斑长度的变异系数在100.0%以上的有遗传背景为A、B、C、E、F和H类品系对菌株FuJ,遗传背景为A、B、D和E类品系对菌株GDA2,遗传背景为A类品系对菌株GD1358和HNA1-4,遗传背景为A和B类品系对菌株PXO86、PXO99,遗传背景为A、C和E类品系对菌株YN24;对14种遗传背景不同品系白叶枯病抗性的方差分析结果表明,不同来源含Xa23基因的品系与7株白叶枯病菌菌株间病斑长度均无显著差异（P>0.05）;对含Xa23基因的品系在7株白叶枯病菌菌株诱发下的菌斑长度的相关性分析结果表明,菌株GD1358、HNA1-4、PXO86和YN24与对应的其他菌株间呈显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）正相关。【结论】在白叶枯病抗性研究时选用菌株GD1358、HNA1-4、PXO86和YN24其中1种抗源接种试验材料,即可得到较宽抗谱的抗性材料,提高育种效率。