棉花GhMGL11基因的克隆和表达分析

为研究陆地棉甲硫氨酸裂解酶(Methionineγ-lyase)基因的结构与功能,本研究以陆地棉中9807叶片为试验材料克隆得到棉花甲硫氨酸裂解酶(Methionineγ-lyase)基因c DNA全长,命名为GhMGL11(Cottongen:Gh_A12G2168)。蛋白序列分析该基因的编码区序列全长1 359 bp,编码452氨基酸;GhMGL11蛋白属于亲水性蛋白,预测含有41个磷酸化位点;亚细胞定位显示位于细胞质,无信号肽。序列比对分析,该基因含有Cys_Met_Meta_PP家族特有的保守结构域Cys_Met_Meta_PP,属于PLP(Pyridoxal phosphate)依赖性氨基转移酶中的一种。系统进化分析,陆地棉GhMGL11蛋白与可可(Theobroma cacao)亲缘关系较近。在陆地棉中发现23个与GhMGL11基因同源的含有Cys_Met_Meta_PP结构域的基因。组织特异性分析,GhMGL11基因在棉花根、茎、叶中均有表达,其中在根中的表达量最高;碱胁迫处理后不同时间内,该基因的表达量先升高后降低,说明该基因表达受碱胁迫影响。     

柠檬F-box基因的克隆及表达分析

本研究以香水柠檬幼嫩叶片为材料,在前期通过De Novo技术获得的F-box基因片段基础上设计引物,利用RT-PCR技术成功克隆出长度为585 bp的F-box基因,命名为LFB1,该基因编码194个氨基酸,该氨基酸序列在N端具有F-box结构域,生物信息学分析表明:该蛋白分子量为48.94 k D,等电点:5.2。进化分析发现其与克里曼丁桔(Citrus clementina)聚在一起。q RT-PCR分析表明:该基因在植株的根、茎、嫩叶、老叶、花蕾、花苞、幼果、成熟果中均有表达,LFB1基因在组织中的表达量是:茎老叶根花蕾成熟果嫩叶幼果;在花的不同器官的表达分析,发现该基因在雄蕊中的表达量最高,其它组织则相对较低,在雄蕊中基因的表达量是其它组织的10倍左右;在逆境胁迫下,该基因的表达量发生明显变化,表明该基因与植株的生长发育、花粉的发育以及环境胁迫可能有着一定的关系。     

陆地棉EPSPS基因的克隆及其组织特异性表达分析

 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）是莽草酸途径中的一个重要酶,它是非选择性除草剂草甘膦的靶标酶,在高等植物中定位于叶绿体质膜上。根据EST拼接的序列设计引物,从陆地棉品种珂字棉312中获得了全长为1834 bp的cDNA序列,其最大可读框为1565 bp,编码521个氨基酸。陆地棉EPSPS基因与其它植物中同类酶在氨基酸水平上有广泛的同源性。通过与已知的其它高等植物叶绿体转运肽剪切位点比对,推断棉花EPSPS基因含有74个氨基酸叶绿体运输肽和447个氨基酸组成的熟蛋白。该酶具有保守的PEP结合位点及催化位点的特征序列。半定量分析表明,该基因产物广泛存在于棉花根、茎和叶等各组织中,在叶片中表达量较高。进一步扩增棉花核基因组获得了3344 bp的DNA序列,它包含8个内含子和7个外显子。棉花EPSPS基因的克隆为抗草甘膦棉花种质资源的创制提供了理论基础。     

棉花SNC2基因的克隆及表达分析

以陆地棉(Gossypium hirsutum)TM-1为材料,利用同源克隆技术从棉花中分离出SNC2基因,以actin基因为内参,采用半定量RT-PCR分析该基因在棉花组织中的表达,并采用实时定量RT-PCR分析不同棉花品种经大丽轮枝菌侵染后,SNC2基因在不同时段、不同组织的表达水平。研究分析发现该基因CDS序列长度为1 308 bp,编码435个氨基酸,蛋白的等电点(p I)为6.98,理论分子量为46.93 k D,命名为SNC2,Gen Bank登录号为AOO35322.1,SNC2基因编码多肽链中包含信号肽和跨膜结构域,且亚细胞定位于质膜,编码受体类蛋白。组织表达分析显示SNC2基因在根、侧根、茎、叶和花中均有表达,茎中的表达量较高,而在苞片组织中基本不表达。该基因在接菌后的感病品种军棉1号的根和耐病品种中棉49号的茎中呈现不断上升的趋势,而在两个棉花品种的其他组织中呈现出"升-降-升"的趋势,且在不同抗性的棉花品种中的表达存在差异,暗示SNC2基因可能在不同抗性品种抵御生物胁迫过程中扮演重要角色,研究结果为进一步研究SNC2基因的功能及应用该基因提供帮助。     

甜瓜PGIP基因的克隆及表达初步分析

以甜瓜叶片基因组DNA为模板,PGIP基因保守序列设计引物,PCR扩增到1条全长978 bp的目的片段。该基因包含有1个完整的开放阅读框,没有内含子,编码326个氨基酸,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列。序列比对表明:该基因编码的氨基酸序列与GenBank中的PGIP基因氨基酸序列(AAP41199)同源性为100%;RT-PCR表达分析表明,该基因在甜瓜叶、茎、根、果实中表达,在花中不表达。为植物分子抗病育种提供了1条基因资源。     

播娘蒿甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和表达分析

采用RT-PCR技术克隆了播娘蒿的甜菜碱醛脱氢酶基因全长cDNA序列(DsBADH)。DsBADHcD-NA序列全长1653bp,其中开放阅读框长1503bp,编码一个由501个氨基酸残基组成的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量为54kD,pI为5.5。序列比对结果表明DsBADH与其它物种的BADHs无论在核酸水平还是在蛋白质水平上都表现较高的同源性,表明BADH基因家族具有较高的保守性。DsBADH基因的氨基酸序列在进化上与同属十字花科植物BADH基因距离较近。蛋白质序列存在一个编码十肽的高度保守序列,该结构在醛脱氢酶中是高度保守的,这些残基可能包含NAD 结合位点及酶催化位点,而且含有与酶功能有关的醛脱氢酶高度保守的氨基酸残基Cys,表明DsBADH可编码活性蛋白。N端存在信号肽,初步将该酶定位于叶绿体。半定量RT-PCR分析表明,DsBADH在根、茎、叶以及角果中均表达,但在角果中的表达显著高于其它组织,而且表明DsBADH受盐诱导正调节表达。     

苎麻ACC合酶基因(BnACS1)的克隆和表达分析

根据苎麻转录组测序中的ACS基因片段, 利用RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆了该基因的全长cDNA序列, 命名为BnACS1, 在GenBank中的登录号为JQ970520。该基因的cDNA序列全长为1 674 bp, 其开放阅读框长1 470 bp, 编码489个氨基酸多肽, 预测其分子量和等电点分别为54.55 kD和6.37, 与苹果(AB034993)、枇杷(GQ370520)、苦瓜(AF248734)、牡丹(DQ337250)、烟草(AY426755)和胡杨(AB033502) ACS基因核苷酸序列的相似性分别为74%、74%、72%、71%、70%和70%, 氨基酸序列的相似性分别为75%、74%、71%、71%、70%和74%。半定量RT-PCR分析表明, BnACS1基因在根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达, 其中在根和雄花中表达较高, 在茎中表达最低。荧光定量PCR分析表明, BnACS1受ABA和干旱的诱导表达上调, 不受高盐诱导表达。     

马铃薯晚疫病抗性相关基因StDIR1的克隆与表达

马铃薯是世界性粮蔬作物。致病疫霉引起的晚疫病则是马铃薯育种所面临的最严峻问题之一,因此,分离和利用马铃薯晚疫病抗性基因获得抗病新品种是马铃薯育种的重要目标。首先在连翘中发现的一类与木质素合成相关的Dirigent基因可能在植物抗病虫害过程中起重要作用。试验根据马铃薯的EST序列信息设计特异性引物,并通过RT-PCR和RACE技术获得了一条全长为729 bp的Dirigent基因cDNA序列,命名为StDIR1;该cDNA编码一个包含191个氨基酸的蛋白质多肽;系统进化分析表明,该多肽是一种Dirigent-like蛋白,属于DIR-b亚群,与陆地棉Di-rigent-like protein 1相似性高达76%,同一性为62%。利用半定量RT-PCR技术分析发现,致病疫霉、H2O2以及NO可以诱导该基因不同程度的上调表达。组织特异性分析表明,该基因在马铃薯根组织中表达量最高,而在茎、叶、花以及块茎组织中的表达量偏低。首次表明StDIR1基因与马铃薯对致病疫霉的侵染应答具有相关性。     

两个陆地棉过氧化物酶cDNA的克隆和鉴定

从陆地棉优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库中分离出2个与过氧化物酶相关的cDNA克隆GhPOD1和GhPOD2。GhPOD1是利用5’RACE技术得到的长度为1 489 bp的完整cDNA序列,开放读码框长度为816 bp,编码271个氨基酸,BLAST结果表明,该基因和拟南芥中已报道的过氧化物酶基因同源性最高。GhPOD2是通过对cDNA克隆直接测序获得,其插入片段长度为1 355 bp,开放读码框长度为999 bp,编码332个氨基酸,BLAST结果表明,该cDNA序列与已报道的1个陆地棉纤维过氧化物酶基因（pod8, L08199）氨基酸相似性达99％。RT－PCR分析表明GhPOD1是一个组成性表达的基因,而GhPOD2在根中不表达,而在茎、叶、胚珠和纤维细胞中表达,并从开花后14 d起,在纤维细胞中表达量逐渐减弱。进化树分析显示GhPOD1与已知的11个过氧化物酶基因距离都较远,是1个新的陆地棉过氧化物酶基因;GhPOD2与相似性高的pod8在同一分支,但与其余的第3类过氧化物酶也有较大的差异。Southern杂交结果表明这两个基因在陆地棉基因组中都存在2个拷贝,推测A、D亚组中各有1个拷贝。GhPOD1和GhPOD2的棉花转基因功能验证正在进行。     

亚洲棉GaPP2C24基因的克隆及表达分析

PP2C是一大类重要的蛋白磷酸酶,广泛参与不同的逆境胁迫响应。为了解PP2C基因在干旱响应中的功能,以亚洲棉石系亚1号为材料,利用RT-PCR方法从中克隆了GaPP2C24基因,并对该基因进行了生物信息学分析,荧光定量PCR研究了其在亚洲棉不同组织和干旱胁迫下的表达情况。结果表明,GaPP2C24基因CDS序列全长为1 251 bp,编码416个氨基酸。序列同源比对发现,GaPP2C24与其他植物的PP2C氨基酸序列有较高的相似性,其中与可可树(EOY33930.1)、黄麻(OMO91132.1)的相似性分别为85%,84%。进化分析表明,GaPP2C24与同属锦葵目的黄麻聚在一支,亲缘关系最近,与可可树的亲缘关系次之。实时荧光定量PCR结果表明,GaPP2C24基因在子叶、下胚轴、胚根、叶、茎和根均有表达,且在茎中的表达量最高,根中次之。GaPP2C24受干旱胁迫的诱导表达,其在根和叶片中的相对表达量在处理1 h后最高,分别达到对照的53.9,6.9倍,推测该基因在棉花干旱响应中有重要作用。     

棉花RAV基因家族的全基因组分析

在二倍体棉花D5基因组(Gossypium raimondii Ulb.)数据库中鉴定出10个RAV基因,分布于4、5、8、9、13号染色体;在二倍体棉花A2基因组(Gossypium arboreum L.)数据库中鉴定出10个RAV基因,与棉花D5基因组的R AV成员的数量和序列具有一一对应的同源关系,推测棉花A、D组的祖先种中可能存在10个RAV基因。对植物R AV蛋白序列做系统发育分析,将R AV成员分为4个组;发现棉花R AV基因可能参与了棉属所特有的基因组多倍化事件的证据。对N CBI中陆地棉(Gssypium hirsutum L.)EST、Unigene数据库做比对统计,得到陆地棉不同组织中R AV基因表达情况;对陆地棉受黄萎病菌胁迫后的荧光定量检测,发现棉花RAV基因与棉花响应黄萎病菌的胁迫相关。     

1个新棉花bHLH类基因GhbHLH130的克隆及表达分析

近年来,已发现碱性/螺旋-环-螺旋(basic/Helix-Loop-Helix,bHLH)类转录因子家族在植物的生长发育调控中发挥重要作用。本研究通过电子克隆方法得到1个新的棉花bHLH类转录因子基因的全长序列,利用反转录-PCR技术从陆地棉中分离出1个bHLH类转录因子基因,并命名为GhbHLH130。该基因包含1个552 bp的开放阅读框,编码184个氨基酸残基。序列分析表明GhbHLH130蛋白包含1个螺旋-环-螺旋(Helix-Loop-Helix)保守结构域,属于bHLH转录因子家族。实时荧光定量分析结果表明GhbHLH130基因的表达受干旱、高盐、低温以及外源脱落酸的显著诱导。亚细胞定位结果表明GhbHLH130基因在细胞核内表达。本研究结果表明GhbHLH130基因可能作为调控基因参与棉花的逆境应答响应过程。     

利用新的外植体建立棉花高效转化系统的研究

利用陆地棉 (Gossypium hirsutum cv.Cok-er3 1 2和 G.hirsutum.晋棉 7号 ,冀合 3 2 1 ) 8～1 2 d无菌苗侧根 1 0 mm切段作为新的外植体与农杆菌 L BA440 4 p BK9(3 5 s∶∶ LUC∶∶ Nos)共培养将外源基因导入棉花 ,成功的获得转基因工程植株 ,提高了愈伤组织和转基因工程植株的转化效率。 p BK9质粒上携带的萤光素酶基因 [Lucif-erous(lux) ]为报告基因 (reporter gene) ,新霉素磷酸转移酶基因 (npt II)为选择标记基因 (markergene) ,经选择获得的转基因工程植株通过 VedioImage System进行整株活体萤光素酶基因 (lux)活性表达检测 ,获得 To 代和 T1代萤光素酶基因(lux)阳性表达植株。进行 DNA分子杂交 (South-ern blot)分析 ,证明外源基因已经整合到棉花基因组中。转基因工程植株萤光素酶基因 (lux)和新霉素磷酸转移酶基因 (npt II)在自交后代中得到保持 ,外源基因呈核基因单一位点显性遗传。     

陆地棉EPSPS基因全基因组分析

当前在NCBI中提交的来源于陆地棉的EPSPS基因有2个,随着陆地棉基因组测序结果的公布,为在陆地棉基因组中全面鉴定EPSPS基因的存在提供了便利条件。从陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据库中共搜寻获得4个EPSPS同源基因,这4个基因分别分布在A07、A12、D07和D12亚基因组。从这4个基因的核苷酸序列、氨基酸序列和基因结构的比对,构建进化树的系统发育分析以及基因的转录情况研究来看,定位在A07和D07亚基因组的2个基因属于共线性高度同源基因,定位在A12和D12亚基因组的2个基因也是相同的情况。序列比对结果表明,已经在NCBI中提交的2个EPSPS基因分别是定位在A12和D12亚基因组上的基因,研究结果为定位在A07和D07亚基因组上EPSPS基因的克隆和功能研究提供了基础理论依据。     

葡萄糖氧化酶基因在棉花中的高效转化——转基因再生棉株的获得

利用农杆菌介导法把葡萄糖氧化酶基因转移到棉花中 ,获得了再生植株 ,并对影响棉花愈伤组织分化和植株再生的因素作了探讨。离体分子检测表明 ,外源基因已整合到棉花基因组中     

陆地棉Nudix基因家族的全基因组鉴定及表达分析

[目的]Nudix是一类能够催化各种核苷二磷酸衍生物水解的酶,具有维持遗传物质稳定,响应逆境胁迫等生物学功能.本研究旨在对陆地棉Nudix基因进行全基因组分析,为深入研究Nudix基因家族参与棉纤维生长发育调控机制提供参考.[方法]通过生物信息学方法对陆地棉基因组(ZJU_v2.1)的Nudix基因进行全基因组鉴定,并...     

一个新的棉花腺体形成基因的遗传鉴定

湘X9628陆地棉突变体具有植株有腺体、种子低棉酚的特性。种子棉仁中的棉酚含量为0.0354%,低于国家标准。它的种子无腺体,当种子萌发后,长出的真叶有腺体,但比常规陆地棉品种少。遗传分析表明,控制湘X9628植株有腺体、种子低棉酚特性由二对重叠隐性基因所控制。等位性测验表明,其中一对基因是gl2的等位基因,另一对是gl     

棉花抗黄萎病相关基因的序列和表达分析

黄萎病是棉花生产的主要病害,克隆抗病基因是培育棉花抗黄萎病品种的关键。本文根据前期的定位结果,结合棉花基因组测序信息,提取定位区段内基因组序列,预测获得63个基因。Gene Ontology分析表明63个基因参加多种生物进程,其中6个基因参与植物抗逆进程。根据Gene Ontology分析和前人研究结果,选择15个基因进行序列分析。启动子序列分析表明启动子区域包含各种抗逆的调控元件,其中6个基因包含了W-box元件。对海7124和苏棉8号棉花幼苗进行黄萎病菌处理,取病菌处理后不同时期的根,选择14个基因进行表达分析,结果表明在黄萎病菌处理后,有8个基因表达出现变化,其中在海7124和苏棉8号之间表达差异最大的基因是跨膜蛋白(Transmembrane protein 214-a isoform 1)、细胞色素P450(Cytochrome p450)和Udp-糖基转移酶UGT89A2(Udp-glycosyl transferase 89a2-like)基因。本研究为抗病基因克隆提供了候选基因。     

比克氏棉及其杂种后代的RAPD分析

 将（亚洲棉×比克氏棉）F₁加倍,再与陆地棉、海岛棉、（陆地棉×夏威夷棉）、（陆地棉×黄褐棉）杂交,获得三种杂种与四种杂种。本研究用RAPD技术对种间杂种及其亲本进行了分析,结果表明：（1）15个引物对参试材料总共扩增出127条DNA带,其中有102条多态性带,占80.3 %;（2）在杂种中均检测到了亲本带与杂种的特异带;（3）利用SAS软件中的类平均法对试验材料进行聚类分析,结果表明,所有的参试材料聚为三大类。研究结果充分验证了杂种的真实性。