小檗碱对玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量及胚胎发育的影响

【目的】探讨小檗碱对玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量及体外受精胚胎发育效果的影响。【方法】体外成熟液和胚胎培养液中添加小檗碱为Ber组,未添加小檗碱为对照组,MII期卵母细胞进行冷冻液处理为冷冻液处理对照组和冷冻液处理+Ber组;采用开放式拉长塑料细管法对卵母细胞玻璃化冷冻与解冻,试验各组别为GV期冷冻组、GV期冷冻+Ber组、MII期冷冻组、MII期冷冻+Ber组。观察卵母细胞体外成熟效果及其体外受精胚胎体外发育效果;观察卵母细胞冷冻化学损伤存活率及其体外受精胚胎发育率;采用尼罗红染色法观察卵母细胞中脂滴含量,观察卵母细胞玻璃化冷冻解冻后存活率及其体外受精胚胎发育率;利用差异染色法和TUNEL法计数囊胚内细胞团和细胞总数以及细胞凋亡数。【结果】Ber组能够极显著促进猪卵母细胞体外成熟,显著降低猪卵母细胞玻璃化冷冻的化学损伤,促进猪卵母细胞冷冻解冻后的细胞存活率,而猪MII期卵母细胞相对于GV期卵母细胞具有很好的冷冻解冻后的存活率;小檗碱能降低猪卵母细胞玻璃化冷冻后的脂滴含量,MⅡ期卵母细胞冷冻前后脂滴含量均低于GV期冷冻前后;小檗碱能够促进猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻解冻后的体外成熟,且有利于猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后早期胚胎的发育,相对于冷冻MII期卵母细胞,冷冻GV期卵母细胞具有更好的体外发育效果;小檗碱能够提高猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后体外发育囊胚内细胞团数与细胞总数,降低其细胞凋亡,有利于提高猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后体外受精胚胎发育至囊胚的质量。而GV期相对MII期则冷冻效果更佳。【结论】小檗碱能够通过降低玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量,从而提高其冷冻解冻后体外成熟率和体外受精胚胎发育质量;GV期玻璃化冷冻卵母细胞相对于MII期,在冷冻解冻后其体外受精胚胎发育质量有更好提高。相关机制还有待今后进一步研究。     

我国首批“试管猪”在江苏省农科院诞生

江苏省农科院胚胎工程研究室范必勤研究员承担了农业部生物技术重点研究项目中的牛、猪、兔体外受精课题。研究者利用屠宰母猪卵巢分离未成熟的卵母细胞,在体外培养成熟处理,后与射出的新鲜精子体外受精,移植8头受     

猪腔前卵泡卵母细胞体外成熟培养初探

【研究目的】为了进一步挖掘猪的遗传潜力,为体外受精、动物克隆和转基因等胚胎生物技术研究提供大量优质卵源。【方法】以极体排出情况为判断标准,采用一步法和两步法成熟培养猪腔前卵泡卵母细胞,来考察猪腔前卵泡卵母细胞最佳成熟方式。【结果】采用任何一种方法卵母细胞经体外成熟后都没有达到MⅡ。然而,腔前卵泡体外培养5d后,分离出的卵丘卵母细胞复合体再培养12d,卵母细胞平均直径达到102.68μm(102.68±12.21),接近正常成熟卵母细胞的体积,为卵母细胞的成熟创造了条件。【结论】用两步法培养猪的腔前卵泡,其卵母细胞能够达到接近正常成熟卵母细胞的体积,说明采用两步法培养猪腔前卵泡卵母细胞是可行的。     

不同洗卵液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期发育的影响

探讨不同洗卵液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期发育的影响,以便开发出简易、经济的洗卵液。结果表明,使用TL-Hepes液、DPBS液、TCM-199()液和TCM-199()液作为洗卵液,对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后的早期发育没有显著影响,说明4种洗卵液均可用于猪卵母细胞的洗涤,但DPBS液配制较简易且价格便宜,是最佳的选择。     

猪胚胎生物技术研究进展

本文就猪的胚胎移植及其相关的胚胎生物技术,包括超数排卵、同期发情、胚胎移植、胚胎体外培养及保存、胚胎分割、嵌合体动物制作、性别控制、卵母细胞体外培养及体外受精、受精卵的基因转移和胚胎的核移植等,进行了综述。     

猪囊胚的体外生产技术

利用屠宰场猪卵巢卵母细胞经体外成熟、体外受精后,体外培育至囊胚阶段,并以体外生产的猪囊胚细胞数来衡量囊胚质量.试验共对5 84 9枚猪卵母细胞进行体外成熟、体外受精,其中3974枚卵母细胞在体外受精后发生卵裂,卵裂率为6 6 4 %±1 6 % ,2 136枚发育形成囊胚,占卵裂胚数的5 6 2 %±2 4 % ,占卵母细胞数的36 7%±1 3% ;检查了98枚囊胚,其平均细胞数为4 1 6±1 8;另外又检查了4 7枚囊胚,其平均内细胞团细胞数为3 85±0 5 6、滋养层细胞数为4 4 70±2 87.     

微流控技术在解决猪体外受精中多精入卵问题中的应用进展

凭借自动化、高灵敏度和高精确度的优势,微流体技术可以实现复杂精细的生物学实验流程控制,保证对试验现象与试验结果的实时准确获取。通过检索近年来微流体装置在哺乳动物卵母细胞体外成熟、体外受精以及胚胎体外培养中的研究报道,总结了微流控技术在哺乳动物胚胎学研究中的应用,提出了将微流控技术应用于猪体外受精技术,目的在于解决并克服猪体外受精中存在的多精入卵,为完善猪体外受精技术提供可行的解决方案,同时为人类医学辅助生殖技术的优化完善提供新思路。     

不同洗卵液对猪卵母细胞体外成熟和

探讨不同洗卵液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期发育的影响,以便开发出简易、经济的洗卵液.结果表明,使用TL-Hepes液、DPBS液、TCM-199 (Ⅰ) 液和TCM-199 (Ⅱ) 液作为洗卵液,对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后的早期发育没有显著影响,说明4种洗卵液均可用于猪卵母细胞的洗涤,但DPBS液配制较简易且价格便宜,是最佳的选择.     

不同培养体系对牛卵母细胞体外受精的影响

[目的]探讨适合于牛卵母细胞体外受精以及受精卵体外培养的最佳培养体系。[方法]通过对成熟的牛卵母细胞分别采用传统培养体系（对照组）和过渡培养体系（试验组）进行体外受精和受精卵体外培养,研究了不同组合的培养体系对受精率和卵裂率的影响。[结果]以受精液为TALP液,受精卵培养液为60%TALP液＋40%M-199液＋5%FCS的过渡培养体系能够提高牛体外成熟卵母细胞的受精率和卵裂率,分别为77.8%和55.6%。[结论]受精液为TALP液,受精卵培养液为60%TALP液＋40%M-199液＋5%FCS的过渡培养体系为牛卵母细胞体外受精以及受精卵体外培养的最佳培养体系。     

17-β-雌二醇对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚的影响

为了观察17-β-雌二醇对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚的影响,选用屠体卵巢上的卵母细胞为试验材料,将其分为4组,分别在培养基中添加0、25、50、75μmol/L 17-β-雌二醇,体外成熟培养时间为36~44 h,受精胚培养时间为9 d。结果表明,在培养基中分别添加17-β-雌二醇0、25、50、75μmol/L时猪卵母细胞体外成熟率分别为58.5%、67.1%、80.9%、64.5%,卵裂率分别为51.2%、56.5%、63.5%、59.2%,囊胚形成率分别为16.7%、24.2%、19.5%、24.0%。结果显示在培养基中添加50μmol/L 17-β-雌二醇可提高猪卵母细胞体外成熟率至80.9%,提高体外受精胚的卵裂率至63.5%,但囊胚形成率以添加量为25μmol/L的组最高,说明添加17-β-雌二醇可提高猪卵母细胞成熟率、卵裂率以及囊胚率。     

猪体外胚胎生产的研究进展

与牛羊等动物的体外胚胎生产（in vitro production，IVP）技术相比，猪IVP技术尚不成熟。猪IVP主要存在卵母细胞的细胞质成熟差、多精子受精率高和胚胎质量差的问题，这严重制约了该繁殖生物技术在转基因猪生物反应器领域的应用。笔者在查阅近10年的国内、外相关研究后，从如何优化猪卵母细胞的体外成熟（in vitro maturation，IVM）、体外受精（in vitro fertilization，IVF）和胚胎的体外培养（in vitro culture，IVC）3个方面进行了探讨。     

家畜体外受精技术研究进展

综述了家畜卵母细胞的采集和体外成熟培养,体外受精及胚胎培养的研究进展,指出了家畜体外受精技术存在的问题和发展前景。     

固醇调节元件结合蛋白1干扰片段/激动剂浓度对猪卵母细胞体外发育效果的影响

【目的】观察并筛选固醇调节元件结合蛋白1干扰片段和激动剂浓度对猪卵母细胞体外成熟的作用。【方法】以猪卵母细胞体外成熟22 h未显微注射为对照组,显微注射阴性片段为阴性对照组,显微注射固醇调节元件结合蛋白1干扰片段(固醇调节元件结合蛋白1-Sus-756、固醇调节元件结合蛋白1-Sus-837、固醇调节元件结合蛋白1-Sus-1104)分别为固醇调节元件结合蛋白1-Sus-756组、固醇调节元件结合蛋白1-Sus-837组和固醇调节元件结合蛋白1-Sus-1104组,显微注射50、75、100、125、150和175 nmol/L固醇调节元件结合蛋白1激动剂分别为50、75、100、125、150和175 nmol/L组,将各组进行体外成熟的卵母细胞体外受精,观察2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚率。【结果】固醇调节元件结合蛋白1-Sus-1104较固醇调节元件结合蛋白1-Sus-756、固醇调节元件结合蛋白1-Sus-837显著降低了猪卵母细胞体外成熟和体外受精囊胚发育率(P0.05),125 nmol/L固醇调节元件结合蛋白1激动剂较其他各浓度组显著提高了猪卵母细胞体外成熟率和体外受精囊胚发育率(P0.05)。【结论】固醇调节元件结合蛋白1-Sus-1104干扰片段和125 nmol/L固醇调节元件结合蛋白1激动剂对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎的发育效果具有显著影响。     

猪卵母细胞体外成熟的影响因素

综述了猪卵母细胞体外成熟的影响因素,并探讨了猪卵母细胞体外成熟的最佳条件和培养体系。     

生长因子和体细胞共培养对牛体外受精的影响

为研究表皮生长因子（EGF）和胰岛素（Insulin）对牛卵母细胞体外发育的影响以及体细胞共培养对体外受精胚胎体外发育的影响,将获取的牛卵泡卵母细胞在含有30μg,LEGF或50mg／L Insulin或30μg／LEGF＋50mg／L Insulin的成熟培养液中进行成熟培养,比较不同生长因子对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响;将受精卵用颗粒细胞单层培养系统或牛输卵管上皮细胞单层培养系统进行体外培养,比较体细胞共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响。结果表明,成熟培养液中添加30μg／LEGF或者30μg／LEGF＋50mg／L Insulin可以显著提高卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率（P〈0．05）;输卵管上皮细胞共培养系统可以显著提高受精后的囊胚发育率（P〈0．05）,可以用于牛体外受精胚胎的体外培养。     

绵羊卵母细胞成熟培养的研究进展

卵母细胞培养是胚胎工程的重要组成部分,是体外受精、胚胎移植及转基因技术的基础。不断完善卵母细胞成熟培养条件,可以大大提高卵母细胞体外成熟的质量,充分发挥绵羊卵母细胞的繁殖潜力。绵羊卵母细胞体外成熟培养受到多种因素的限制,其中培养液成分包括基础培养基、血清、激素、卵泡液、生长因子、抗氧化物和维生素等6个方面。笔者对绵羊卵母细胞成熟培养的培养液成分相关研究进展进行综述,旨在提高绵羊卵母细胞体外成熟培养的质量和促进体外胚胎技术研究。     

已糖对猪卵母细胞体外成熟及体外受精后囊胚发育能力的影响

以NCSU-37为基础培养基,观察了葡萄糖、果糖和乳糖3种已糖对猪卵母细胞体外成熟和体外受精能力的影响,结果:①与浓度2.51、0.0 mmol/L比较,葡萄糖或果糖浓度为5.5 mmol/L时,猪卵母细胞MII期成熟率较高(P<0.05);而不同浓度的半乳糖对MII期成熟率无明显影响。②猪成熟卵母细胞体外受精后,葡萄糖或果糖组囊胚率分别为8.6%和8.2%,显著高于对照组及半乳糖组2.9%和9.2%(P<0.05);但对囊胚进行地衣红压片显示,果糖组囊胚质量达到A级率为43.2%(10/23),显著高于葡萄糖组24.3%(6/25)。研究表明,果糖对于猪卵母细胞的体外成熟及体外生产高质量囊胚效果较好。     

玻璃化冷冻对猪卵母细胞体外发育能力的影响

采用猪未成熟(GV期)和体外成熟(MⅡ期)卵母细胞分组进行冷冻保护剂毒性试验,试验组经冷冻液处理,对照组不用冷冻液处理。结果表明,GV期与MⅡ期卵母细胞相比,两者经冷冻保护剂处理后,其存活率、体外受精胚卵裂率均无显著差异(P>0.05);试验组GV期卵母细胞存活率、体外成熟率及体外受精胚卵裂率虽略低于对照组(85.9%,72.4%和50.9%对91.3%,73.9%和53.3%),但差异不显著(P>0.05);试验组MⅡ期卵母细胞存活率虽显著低于对照组,但卵裂率与对照组无显著差异(P>0.05)。表明所用冷冻液及其处理程序,对卵母细胞无明显毒性。分3组对猪卵母细胞进行冷冻保存试验:I组为对照组;II组为GV期卵母细胞冷冻组;III组为MⅡ期卵母细胞冷冻组。结果表明,经开放式拉管(Open pulled straw,OPS)法玻璃化冷冻后,GV期和MⅡ期卵母细胞均获得较高的形态正常率,但GV期卵母细胞冷冻后存活率要显著高于MⅡ期卵母细胞(P<0.05)。经玻璃化冷冻后,GV期卵母细胞的体外成熟率和卵裂率均明显低于新鲜卵母细胞(42.6%和7.79%对73.9%和53.3%,P<0.05),MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后未获得卵裂。在GV期卵母细胞冷冻组,154枚卵母细胞冷冻后经体外成熟、体外受精及体外培养,共有12枚发生卵裂,其中6枚发育至8-细胞,3枚发育至16-细胞,3枚发育至桑椹胚。本研究表明,所用冷冻方案更适合于猪GV期卵母细胞的冷冻保存。     

猪卵母细胞体外成熟技术研究进展

猪卵母细胞体外成熟(IVM)为猪胚胎的体外生产及相关胚胎工程技术如胚胎细胞和体细胞核移植、转基因和性别控制提供了廉价原料,是现代胚胎工程技术的研究热点之一。多年来科研人员为了进一步提高卵母细胞体外培养成熟率以及更深入地了解卵母细胞成熟机制,对影响卵母细胞体外成熟的因素进行了大量的研究。综述了影响猪卵母细胞体外成熟的相关因素。     

猪卵母细胞体外成熟的无血清培养模型的建立

实验模拟活体卵泡环境研究了猪卵母细胞体外自发成熟和次黄嘌啉（HX）对体外自发成熟的影响，建立了猪卵母细胞体外成熟的无血清培养模型。结果表明，猪卵丘－卵母细胞复合体（CEO）和裸卵母细胞（DO）在M－199培养基中能够自发成熟；HX能够剂量依赖性地且可逆性地抑制猪卵母细胞体外自发成熟。