水稻多逆境响应基因OsMsr13的克隆与功能分析

为了深入研究作物耐逆境胁迫的分子机制和发现新的水稻耐逆基因,采用Affymetrix基因芯片技术与水稻表达芯片(含51,279个转录本),分析了培矮64S不同生长发育时期、不同组织器官全基因组在低温、干旱、高温逆境胁迫下的表达水平变化,筛选出一批耐多逆境候选功能基因.OsMsr13是其中一个受低温、高温与干旱诱导,在各生长发育时期与组织器官均显著上调的基因.根据序列生物信息学分析,OsMsr13含有7个外显子和6个内含子,cDNA全长序列为1603bp,完整的ORF为1317bp,编码一个含438个氨基酸残基的蛋白质;在OsMsr13启动子区域发现多个与逆境应答相关的顺武作用元件;数据库查找和蛋白质多序列的比对表明Os Msr13的预测蛋白属于钙调素结合蛋白家族.为了进一步研究OsMsr13基因的功能,通过RT-PCR方法扩增到包含OsMsr13完整ORF的cDNA克隆,构建了含有OsMsr13重组基因的过量表达载体pCAM-JIT-OsMsr13,并经农杆菌介导法将重组基因导入到水稻中.转OsMsr13株系苗期的抗逆性试验表明OsMsr13过量表达能显著地提高水稻的耐寒性,但在抗旱和耐高温方面,转基因植株和野生型9311没有观察到多大差别.     

水稻多逆境响应基因OsGAD3的表达与克隆

逆境胁迫严重影响植物的生长发育,对农业生产造成相当大的影响。为了了解植物逆境反应机理和发现新的水稻耐逆基因,采用Affymetrix水稻表达芯片分析了籼稻培矮64S在多种逆境胁迫下的表达水平,筛选出一个受多种逆境诱导、在各生长发育时期与组织器官均有响应的基因OsGAD3(Oryza sativa L.,Glutamate decarboxylase 3,GenBank登录号为:AY187941.1)。PCR扩增得到了该基因的cDNA,其包含的ORF长1476 bp,编码一个含有492个氨基酸残基的蛋白,分子量约为56 kD,等电点约为5.64。OsGAD3基因编码的蛋白质有多个保守结构域,经序列比对发现,其与水稻谷氨酸脱羧酶3相似性约为99.7%。启动子区域分析,发现多种与逆境反应相关的顺式作用元件,因此推测此基因可能参与水稻的耐逆反应过程。     

水稻逆境响应基因OsMsr11的克隆与分析

为了挖掘新的耐逆基因,本文在应用Affymetrix水稻表达芯片分析超级稻亲本培矮64S在不同逆境(高温、干旱、低温)胁迫下、不同发育时期叶片和穗中全基因组表达模式的基础上,对其中一个多逆境响应基因OsMsr11(Oryza sativa L.multiple stressresponsive gene 11)进行了克隆与分析。OsMsr11是一个受低温、干旱、高温多逆境诱导的基因,在孕穗期低温胁迫下表达水平显著上调。通过PCR扩增获得了包含其完整开放阅读框的cDNA序列。序列分析表明,其ORF为234 bp,编码77个氨基酸,有信号肽序列,无典型的保守基因结构域,预测其为分泌通路信号肽,分泌到细胞周质中,功能未知;OsMsr11基因不含内含子,对其启动子区域进行分析,发现含有多种与逆境响应相关的顺式作用元件。为研究其功能,采用农杆菌侵染法转化超级稻父本9311,初步分析表明:在水稻中过量表达OsMsr11,增强了转基因水稻的耐盐性,降低了对外源ABA的敏感性。     

水稻GSK基因家族的鉴定及其对多种激素和逆境应答的表达量分析

通过序列比对分析鉴定出9个GSK同源基因(命名为OsGSK1-9),它们分布在水稻的6条染色体上。聚类分析表明预测的OsGSK蛋白和其他植物中的GSK蛋白可被分为4个亚组。通过实时定量PCR进一步分析了OsGSK基因家族的基因在水稻各种组织和器官以及在多种逆境胁迫和植物激素处理条件下的表达量。结果表明:大多数OsGSK基因在水稻全生育期都有较高的表达量并且受多种激素(如脱落酸、生长素、油菜素内酯)和逆境(如干旱和盐胁迫)胁迫诱导表达,表明OsGSK基因家族在水稻发育和逆境适应过程中可能起重要作用。     

甘蔗ABA生物合成关键酶SoNCED基因克隆及表达分析

[目的]克隆甘蔗体内9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)基因,分析其基本生物学信息及在逆境胁迫下的表达分析,为进一步探讨SoNCED基因在甘蔗脱落酸(ABA)生物合成途径中的作用提供理论依据.[方法]以甘蔗品种桂糖21号为材料,待蔗苗长至5~6片叶时分别进行干旱、低温、高盐和氧化胁迫处理,利用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA未端快速扩增(RACE-PCR)克隆SoNCED基因,应用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,构建原核表达载体并进行目的蛋白的诱导表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析SoNCED基因在受到不同逆境胁迫时的表达情况.[结果]克隆获得的SoNCED基因(GenBank登录号JQ314108),cDNA全长为2521 bp,包含1个1827 bp的开放阅读框(ORF),编码608个氨基酸.多重序列比对及系统发育进化树分析结果表明,SoNCED基因编码的氨基酸序列与其他植物有一定的相似性,尤其与禾本科C4植物高粱和玉米的同源性最高,均达96%.成功构建SoNCED基因的原核表达载体pET-SoNCED,且通过IPTG诱导时可得到约66.0 kD的蛋白,确定该蛋白为SoNCE基因的表达蛋白.qRT-PCR结果分析表明,SoNCED基因在干旱、低温、高盐和氧化胁迫下均能诱导表达,其中氧化胁迫下其表达量在6h时达峰值,其他胁迫方式下其表达量在12h时达峰值.[结论]成功克隆获得甘蔗SoNCED基因,并从不同逆境下的表达情况推测该基因在甘蔗体内参与了干旱、低温、高盐和氧化等非生物胁迫的调控过程.     

水稻黄嘌呤脱氢酶基因OsXDH克隆及表达分析

[目的]克隆水稻黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)基因(OsXDH),分析其生物信息学特性及表达特性,为研究XDH在水稻生长发育和响应逆境胁迫中的调控机制提供理论依据.[方法]以粳稻品种日本晴为材料,采用同源克隆技术克隆OsXDH基因,应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行分析.利用实时荧光定量PCR (qPCR)检测OsXDH基因的组织表达特性及逆境胁迫下的表达情况,并对不同转基因株系乳熟期剑叶OsXDH基因表达量、XDH活性和叶绿素含量进行比较分析.[结果]克隆获得OsXDH基因的开放阅读框序列(ORF)(GenBank登录号LOC4333171),其长度为4110 bp,编码1369个氨基酸.OsXDH蛋白分子量大小为150.23 kD,理论等电点(pI)为6.54,与小麦、高粱、玉米、谷子和油菜等作物XDH蛋白氨基酸序列的相似性分别为84.54%、84.07%、81.52%、76.35%和69.22%,表明XDH蛋白氨基酸序列具有高度保守性.OsXDH基因在水稻不同组织部位均有表达,灌浆期的表达量显著高于苗期和分蘖盛期(P<0.05),且受干旱、黑暗、高温和盐胁迫诱导高效表达.OsXDH过表达水稻转基因株系乳熟期剑叶的XDH活性和叶绿素含量高于野生型,OsXDH干扰转基因株系的XDH活性和叶绿素含量低于野生型.[结论]OsXDH基因受水稻生长发育和逆境胁迫因子诱导表达,推测其是调控水稻生长发育和响应逆境胁迫的关键基因.     

一个逆境诱导表达的水稻锌指蛋白基因的分离和鉴定

为鉴定逆境应答相关转录因子,以1个水稻EST为基础,通过RT-PCR分离到了1个编码锌指蛋白的转录因子新基因的全长cDNA,命名为OsZF19。该基因编码171个氨基酸,包含zf-AN1和zf-A20两个锌指结构域,预测的该基因启动子区含有逆境应答顺式元件。Northern杂交分析表明,OsZF19的确受到高盐和植物激素ABA胁迫的诱导,而在干旱胁迫早期显著地诱导表达,胁迫后期OsZF19的表达量轻微下降。试验结果表明,OsZF19可能在水稻对干旱和高盐逆境的应答反应中发挥作用。     

不结球白菜醛酮还原酶BcAKR4C9基因的克隆及表达分析

[目的]本文旨在探究醛酮还原酶AKR4C亚家族BcAKR4C9基因在不同激素处理及逆境胁迫中的表达模式,从而分析BcAKR4C9基因在不结球白菜作物中的生长代谢和逆境胁迫中可能发挥的作用。[方法]以不结球白菜‘苏州青’为材料,克隆了BcAKR4C9基因的全长,应用生物信息学分析了其氨基酸序列,并通过实时荧光定量PCR技术分析BcAKR4C9基因在不同组织,高温、低温、NaCl胁迫、伤害胁迫,以及水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸等处理下的基因表达变化。[结果]序列分析表明,BcAKR4C9基因包含1个长度为948 bp的开放式阅读框(ORF),编码315个氨基酸。氨基酸序列多重比对和进化树分析表明,BcAKR4C9与其他植物AKR4C9基因同源性较高,具有高度保守性。荧光定量PCR分析表明,BcAKR4C9在叶片中的表达量高于根中,高温和低温处理下表达上调,且具有相似的表达模式。在0~20 g·L~(-1) NaCl质量浓度范围内基因相对表达量随NaCl质量浓度的升高而升高,伤害处理后能够迅速产生应激响应,并能够被水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸诱导表达。[结论]不结球白菜BcAKR4C9基因能够被不同激素诱导表达,并且参与到多种逆境胁迫响应。     

水稻OsKAT2基因的克隆及表达分析

为获得抵抗逆境胁迫的相关基因,利用电子克隆方法从水稻中获得了1个新基因,将其命名为OsKAT2(GenBank登陆号为KJ010541)。生物信息学分析结果表明OsKAT2的cDNA序列开放阅读框长1 806 bp,编码蛋白质由601个氨基酸组成;OsKAT2蛋白质包含K+通道的保守结构域,属于Shaker家族第II组。通过实时定量荧光PCR分析发现,OsKAT2主要在地上部表达;在干旱、高盐和外源脱落酸(ABA)胁迫处理下,水稻地上部OsKAT2的表达量均降低。初步推测OsKAT2可能在水稻抵抗逆境胁迫中发挥作用,是一个水稻抗非生物逆境改良的候选基因。     

巴西橡胶树谷氨酸脱氢酶基因cDNA片段克隆及表达分析

谷氨酸脱氢酶[Glutamate dehydrogenase,(GDH;E.C.1.1.4.2)]在植物处于逆境或胁迫时,发挥着重要的作用,主要功能可能是解除逆境或胁迫条件下高浓度的铵毒害.该研究通过同源克隆从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中获得谷氨酸脱氢酶基因(HbGDH)的部分cDNA片段(GeneBank登录号:DQ672585),基蛋白包含一个谷氨酸脱氢酶保守结构域.BLAST比对表明HbGDH基因与拟南芥(Arabidopis thaliana)、水稻(Oryza sati-va)GDH基因分别有82%、79%的同源率;系统进化树分析发现HbGDH蛋白与拟南芥、水稻GDH蛋白聚为一簇;不同组织的表达分析表明HbGDH基因在胶乳中表达较高,叶片中次之,树皮中最低.     

水稻籼粳杂种不育性的遗传机理及杂种优势利用

籼稻和粳稻是亚洲栽培稻的两个亚种,两者在形态、生理以及基因水平上存在显著差异,亚种间的遗传差异将会产生强大的杂种优势,能进一步提高水稻的产量潜力,但是,籼粳亚种间的 F1 杂种不育性严重阻碍了杂种优势的利用。杂种不育性是一种合子后生殖隔离,具有普遍性和复杂性,受多个不育基因座控制。广亲和品种的发现为克服亚种间杂种不育提供可能,该材料无论与籼稻还是粳稻杂交,F1 杂种都能正常结实或结实率较高。概述了籼稻与粳稻间差异,剖析了水稻籼粳亚种间杂种不育的遗传基础、已鉴定的杂种不育主效QTL 与基因,分析了已克隆杂种不育基因的分子作用机制及广亲和基因的功能。据此提出利用籼粳架桥培育亚种间渗入水稻、聚合育种培育广亲和系和粳型亲籼系,以及应用基因编辑技术创制广亲和系等途径,能够克服籼粳亚种间杂种不育性,精准化改良籼粳杂种的结实率,从而实现亚种间杂种优势的利用。籼粳亚种间杂交水稻的推广应用,将会推动水稻产业的又一次重大变革。     

农杆菌介导的双SBE基因RNAi载体对水稻的遗传转化

[目的]提高水稻中直链淀粉的含量,扩大稻米的利用范围。[方法]以水稻中花11品种为材料,通过农杆菌介导法,侵染水稻幼胚诱导出的愈伤组织,将淀粉分支酶基因SBE1和SBE3同时导入受体愈伤组织,经过一系列的共培养、预分化、分化、生根壮苗后,获得含有转基因的转化植株,并对转化植株进行PCR鉴定。[结果]通过用根癌农杆菌介导法,侵染由水稻幼胚诱导的274粒愈伤组织,经过共培养、筛选,得到177粒抗性愈伤,然后将抗性愈伤预分化、分化得到103株分化苗,生根壮苗后获得49株转基因植株;从49株转基因植株中随机提取34株的基因组DNA,利用PCR技术从基因组DNA中扩增得到了片段大小约为500 bp的潮霉素基因序列。[结论]初步证实转基因植株的真实性,淀粉分支酶基因SBE1+SBE3成功整合进入水稻基因组中。     

水稻PIN家族的生物信息学分析

作为植物中最重要的生长素外输载体,PIN家族在各种植物中都拥有众多成员。对水稻基因组的BLAST搜索获得了12个PIN家族成员,分析发现:水稻PIN基因不均衡地分布在基因组染色体上;其内含子、外显子结构类似;PIN蛋白质拥有典型的载体蛋白序列特征,即亲/疏水性反复变化,存在多次跨膜结构域;几乎所有PIN蛋白都有一个NPNXY的内化结构域和7个功能未知的基序;PIN在早期即分化为两组成员,主要区别在于中间亲水环的部分缺失;并且在后来发生了支系特异的复制事件,从而形成了众多旁系同源基因。     

水稻耐热性研究进展

随着"温室效应"的不断加剧,温度的不断升高,高温已成为制约农业生产的重要非生物胁迫因素之一.综述了高温对水稻生长发育、产量构成因素、稻米品质、生理生化的影响,耐热性鉴定和评价指标、耐高温遗传机理以及耐高温育种等方面的研究进展,并对将来进行水稻耐热性研究提出了一些建议.     

粳稻籽粒性状遗传分析

[目的]对籽粒相关性状进行遗传分析,为水稻高产改良提供指导。[方法]以秀水79和C堡构建的247个株系粳粳交重组自交系群体为试验材料,测定了籽粒相关性状(粒长、粒宽、粒重及长宽比)的表型值,利用主基因+多基因混合遗传模型对其进行遗传分析。[结果]粳稻粒长和粒重都受到3对主基因控制,二者均无多基因控制。粒宽为2对主基因控制无多基因的作用方式,粒长、粒宽和粒重主基因的遗传率均在99%以上。籽粒长宽比由多基因控制。[结论]粳稻粒长、粒重和粒宽受到主基因控制。     

太湖流域粳稻群体遗传结构分化和亚群特异性分析

目的:研究太湖流域粳稻群体的遗传结构分化以及不同生态亚群的遗传多样性、特异性及其相互关系,为太湖流域亲本遴选提供遗传背景依据。方法:从太湖流域823份地方品种构成的核心种质中筛选出58份品种和36份育成品种构成代表样品,选用均匀分布12条染色体上的91个标记,采用Structure Version2.2软件,对粳稻群体遗传多样性、亚群遗传分化及特异性进行分析。结果:太湖流域粳稻群体由8类血缘组成,遗传上可分为5个生态亚群,每个亚群的血缘构成各不相同。不同的生态亚群中含有各自的特有和特缺等位变异,其中生态型Ⅲ特有等位变异数最多,对其他4个亚群其具有最多的补充等位变异。     

水稻矮秆基因克隆研究进展

矮秆是水稻育种中最重要的农艺性状之一,对增强水稻抗倒伏性、提高水稻产量有重要作用。综述了水稻矮秆基因的分类,并从参与油菜素内酯、赤霉素、独角金内酯、生长素等生物合成或信号传导途径方面阐述了水稻矮秆基因的克隆情况,为矮秆突变基因在水稻育种中的应用提供理论依据。     

水稻腈水解酶蛋白家族的生物信息学分析

腈水解酶在植物的生命过程中起重要作用。本文对水稻中的腈水解酶进行了一系列的生物信息学分析,结果发现水稻中共有8个腈水解酶,他们都具有典型的碳氮水解酶结构域。通过ESTs搜索发现这些基因在水稻不同组织和不同胁迫条件下的的表达情况存在较大的差异。此外,对水稻的腈水解酶家族作了初步的进化分析。研究结果为进一步研究该类蛋白的分子和生物学功能奠定了良好基础。