稀有鱼句鲫β肌动蛋白启动子的克隆及其驱动活性的初步检测

稀有鮈鲫是一种新型的模式实验鱼,具有利用转基因技术培育开发成为观赏性鱼类的潜在可能。本实验采用PCR方法,从稀有鮈鲫基因组DNA中分离得到大小为1584bp的β肌动蛋白(β-actin)基因片段。序列分析表明,该片段包括长为1507bp的启动调控区和77bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为109bpβ-actin基因上游调控序列,不翻译的外显子1和内含子1。上游调控序列中含有TATAbox,CAATbox和CArGbox等与转录活性密切相关的作用元件,并且在稀有鮈鲫β-actin基因第一个内含子中也含有1个CArG调控元件。将该启动子片段克隆到绿色荧光表达载体(pAcGFP1-1)上,显微注射入稀有鮈鲫的受精卵中,通过荧光显微镜能观察到绿色荧光蛋白的表达。本实验成功分离了具有驱动活性的稀有鮈鲫β-actin基因启动子。     

稀有鮈鲫β-肌动蛋白启动子的克隆及其驱动活性的初步检测

稀有鮈鲫是一种新型的模式实验鱼,具有利用转基因技术培育开发成为观赏性鱼类的潜在可能。本实验采用PCR方法,从稀有鮈鲫基因组DNA中分离得到大小为1584bp的β肌动蛋白(β-actin)基因片段。序列分析表明,该片段包括长为1507bp的启动调控区和77bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为109bpβ-actin基因上游调控序列,不翻译的外显子1和内含子1。上游调控序列中含有TATAbox,CAATbox和CArGbox等与转录活性密切相关的作用元件,并且在稀有鮈鲫β-actin基因第一个内含子中也含有1个CArG调控元件。将该启动子片段克隆到绿色荧光表达载体(pAcGFP1-1)上,显微注射入稀有鮈鲫的受精卵中,通过荧光显微镜能观察到绿色荧光蛋白的表达。本实验成功分离了具有驱动活性的稀有鮈鲫β-actin基因启动子。     

唐鱼β-肌动蛋白基因启动子的分离及其驱动活性的检测

利用PCR技术克隆唐鱼（Tanichthys albonubes）β-actin基因。所克隆的β-aetin基因片段为1464bp,包含长为1374bp的启动调控区和90bp的部分开放阅读框。启动调控区包括105bp的β-actin基因上游调控序列、第一个外显子和第一个内含子。上游调控序列中含有对转录起重要作用的CAAT Box、TATA Box、CArG Box等元件。将唐鱼β-actin启动调控区克隆到红色荧光表达载体pDsRed2-1上,并显微注射到唐鱼受精卵中,荧光显微镜观察红色荧光蛋白（RFP）的表达。结果表明,RFP在转基因唐鱼中的表达阳性率较高,最高可达51．8％,且RFP的表达水平较高。PCR检测转基因唐鱼的部分器官组织,在被检组织器官中均能检测到外源RFP基因;而RT-PCR以及Southern blot验证显示RFP mRNA的表达有所不同;Southern blot检测肌肉组织基因组DNA,可见比阳性载体大的杂交条带。说明所检测的组织中已发生外源基因RFP的整合,但有些组织存在表达水平较低或者不表达的现象。本实验分离到的β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能,可启动外源基因在唐鱼体内的高效表达,从而为下一步进行功能基因的转化研究奠定基础。     

鲮β-肌动蛋白基因的分子克隆及其作为分子内标的可靠性分析

β-actin是actin家族的一员，在维持细胞结构、细胞内运动和细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。克隆的鲮（Cirrhinus molitorella）β-aetin基因的cDNA全长1 804bp，开放阅读框长1 128bp，编码375个氨基酸，5’和3’末端非翻译区域（UTR）分别为94bp和582bp。RT-PCR结果表明，β-actin在未经LPS刺激的和经LPS刺激的鲮心脏、肾脏、肌肉、肝脏、脾脏、肠、脑和皮肤等8种组织中广谱表达，表达水平没有明显差异，可以作为基因表达调控研究的分子内标。鲮与其他鱼类β-actin基因编码区核苷酸序列同源性在85.9％～99.6％。分子系统进化树分析表明，可将鱼类分成鲤形目，鲈形目，鲑形目和合鳃目4大支，与传统分类一致，β-actin基因核苷酸序列是研究分子进化的一个很好的分子标记。     

斑节对虾亲环素A （cyclophilinA） 基因的克隆及启动子序列分析

通过同源克隆和RACE技术获得斑节对虾(Penaeus monodon)亲环素A(cyclophilin A,CYPA)的cDNA序列.根据已克隆的cDNA序列设计引物,利用染色体步移技术(Cenomic DNA walking)从斑节对虾卵巢组织中克隆了CYPA基因的启动子和基因组DNA序列.测序结果表明,斑节对虾亲环素A(PmCYPA)cDNA全长834 bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)为495 bp,可编码164个氨基酸;5'非编码区为31 bp,3'非编码区为308 bp.从斑节对虾基因组文库中扩增的CYPA基因组DNA全长3 181 bp,其中包括启动子区域1 173 bp,1个内含子426 bp,2个外显子序列:分别为101 bp和399bp.在5'UTR上游区域有明显的启动子序列,包含一个GC盒和2个CAAT盒,同时还包含AP1、CRE等调控元件,符合真核生物典型的启动子特征.分析基因的结构表明所克隆的PmCYPA符合PPlase家族成员特征,属于此基因家族成员.     

泥鳅β-actin启动子介导的革胡子鲶GH重组基因的构建及启动活性研究

为获得快速生长的泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus),研究了泥鳅β-actin基因启动子介导的革胡子鲶(Clarias gariepinus)生长激素(growth hormone,GH)重组基因。采用PCR和RT-PCR技术克隆泥鳅β-actin基因近端启动子、3′-UTR及革胡子鲶GH基因编码区,构建一个长为2 418bp的GH重组基因DPRK。首先,构建了以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因的重组表达载体p AF(pβ-actin promoter-EGFP),然后转染DF1真核细胞,同时经酶切线性化后显微注射到斑马鱼(Danio rerio)和泥鳅的受精卵中,以评价泥鳅β-actin启动子的启动活性。其次,将重组基因DPRK显微注射到泥鳅受精卵中。结果显示:泥鳅β-actin启动子能在DF1细胞、斑马鱼和泥鳅的受精卵中启动绿色荧光蛋白的表达;泥鳅的荧光表达率(78.44%)显著高于斑马鱼(29.62%);泥鳅受精卵显微注射DPRK 20d后,在m RNA水平检测到GH基因的表达。这表明泥鳅β-actin基因近端启动子具有显著的启动活性,且重组基因DPRK能在泥鳅体内表达,为下一步泥鳅的基因工程育种奠定了理论基础。     

大黄鱼slitrk3基因启动子克隆及转录调控分析

神经突触相关蛋白Slitrk3具有调节抑制性突触发育的作用。研究大黄鱼(Larimichthys crocea)神经突触黏附分子slitrk3基因的转录调控机制,可为解决大黄鱼养殖面临的生长、应激及抗逆等问题提供新思路。通过生物信息学方法对大黄鱼及其他物种的Slitrk3氨基酸进行多重序列比对和系统进化树分析,并预测大黄鱼slitrk3基因启动子区域相关的调控元件,采用双荧光素酶报告基因系统检测大黄鱼slitrk3基因启动子区域的转录活性。生物信息学分析结果显示,Slitrk3氨基酸序列在鱼类中具有较高的保守性;大黄鱼slitrk3基因启动子区域预测存在2个潜在的转录起始位点、2个CpG岛以及Sp1、GR、C/EBPα和C/EBPβ等多种转录因子结合位点。双荧光素酶报告基因系统结果显示,大黄鱼slitrk3基因启动子区域的-1 970—-1 614 bp、-1 210—-667 bp存在正调控元件,-1 614—-1 210 bp、-667—-376 bp、-376—-147bp存在负调控元件,推测-147—+16 bp为核心启动子。     

虹鳟免疫诱导型基因Cathelicidin2启动子功能分析

本研究通过实时荧光定量PCR实验对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)Cathelicidin2(Cath2)基因的转录模式进行了分析。结果显示,该基因在鳃、头肾等与机体免疫防御功能密切相关的组织内转录,在细菌和病毒感染后,转录水平均显著升高。对基因上游调控序列进行启动子和转录因子结合位点预测,发现该启动子具有真核生物典型的TATA盒和CAAT盒结构,基因上游直至第一内含子区域内,密集存在多个免疫相关转录因子结合位点,其中,2个核因子κB(Nuclear factor kappa B,NFκB)预测结合位点均位于核心启动子正链区域。在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾组织细胞系内,绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶基因都能够在该启动子驱动下表达,表明其具有启动子活性,且启动子活性在受到免疫诱导后增强,包括细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)模拟的细菌感染和聚肌胞苷酸(Polyinosinic polycytidylic acid,Poly I:C)模拟的病毒感染。双荧光素酶报告基因检测显示,启动子活性在与NFκB转录因子表达时,增强至4.39倍,证明Cath2基因受NFκB通路调控。研究表明,虹鳟Cath2基因能够在多种免疫刺激诱导下表达,其启动子可以应用为免疫诱导型的基因工程元件,驱动外源免疫基因在鱼体内适时表达,抵御外界病原感染,同时,避免非必要条件下的过度表达形成生长负担。     

尼罗罗非鱼β-actin基因启动子的分离及其在真核细胞中的活性验证

采用高保真PCR方法从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)基因组DNA中分离出β-actin基因启动子序列,将β-actin基因启动子插入pN1-EGFP构建成真核细胞表达载体pEGFP-β-actin,并通过脂质体转染法将重组载体导入人胚肾上皮细胞HEK 293T,荧光显微镜下观察外源基因EGFP...     

大口黑鲈MyoD基因结构和单核苷酸多态性位点的筛选

本研究采用PCR技术和基因组步移技术从大口黑鲈基因组DNA中扩增得到MyoD基因及其5’调控区序列。该基因序列全长3797bp,其中5’调控区长1077bp,MyoD基因转录区由3个外显子（分别为591bp、81bp和78bp）和2个内含子（分别为1077bp和486bp）组成。5’调控区含有与肌肉特异性基因转录密切相关的转录调控元件E box、肌细胞增强因子2（MEF2）、肌肉特异性金属硫蛋白结合位点（MTBF）及一些转录反应调控元件（TATA box 、OCAAT box、OCT1、PRE、AP4、Pit1）。运用PCR-SSCP技术和直接测序法进行大口黑鲈MyoD基因SNP位点筛选,结果表明MyoD基因序列中存在7个突变点,均位于内含子上。养殖群体中这7个突变点分析结果显示突变比例范围在0.042～0.353之间。本研究结果为SNPs位点与大口黑鲈生长性能关联分析奠定了基础。     

“全鱼”Mx基因重组构建与转导分析

通过分子重组将鲫Mx1基因的编码序列克隆到鲤β肌动蛋白基因启动子下游,构建成能在鱼体内表达的转“全鱼”Mx基因的重组分子.采用显微注射方法,将含有鲤β肌动蛋白基因启动子和鲫Mxl基因序列的重组片段转入草鱼受精卵中,经人工孵化和养殖获得转全鱼Mx基因草鱼.经PCR和Southern杂交检测分析,证实重组分子成功整合到2月龄转基因草鱼基因组中,为草鱼抗病育种研究奠定了基础.     

牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的功能分析及甲状腺激素对其调节作用

为分析牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区和第一内含子调控序列的功能,本研究运用DNA重组技术将PCR扩增得到的牙鲆碱性磷酸酶基因的5′调控区序列、第一内含子序列及5′调控区和第一内含子串联序列分别插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pAcGFP1-1中,得到pAcGFP1-5′ALP、pAcGFP1-Intron1和pAcGFP1-AI报告基因表达载体。通过脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并检测荧光信号。转染后细胞状态良好,24 h后发现,在倒置荧光显微镜下均可看到不同强度的绿色荧光信号,且荧光信号随时间的延长而增强,其中转染pAcGFP1-AI后的荧光信号强度最强。以上结果表明,牙鲆碱性磷酸酶基因5′调控区和第一个内含子序列均具有启动子活性,且第一内含子与5′调控区存在协同效应,两者协同能增强基因的表达。为了解甲状腺激素T3对调控序列启动子活性的调节作用,用不同浓度的T3处理转染的CHO细胞,24 h后发现加入50、75和100 nM的T3都增强了绿色荧光蛋白的表达,而且信号强度随T3浓度的增加而增强。这表明甲状腺激素T3对牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的启动子活性有一定的增强作用。本研究为深入阐明牙鲆碱性磷酸酶基因转录表达的分子机制提供了实验依据。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)Activin基因两种β亚基的启动子克隆及生物信息学分析

以牙鲆为研究对象,利用染色体步移(Genome walking)获得了Activin两个β亚基基因的上游部分启动子序列,并对其进行了转录调控元件的生物信息学预测分析。获得了ActivinβA和βB两个亚基的启动子部分序列,长度分别约为2.7 kb和2.4 kb;在预测的ActivinβB转录起始位点(+1位)的上游31 bp处有1个典型的TATA box,而在ActivinβA中未发现TATA box的存在。两个基因的启动子上发现了多个转录因子Sp1、Oct-1、C/EBP、CREB、GATA-1、HNF-3、HNF-1、USF等结合位点,还发现了与内分泌相关的Pit-1、ER、PR、GR、RAR、RXR等结合位点,但肌性转录因子Myo D、myogenin和雄性的性别决定基因SRY结合位点仅在ActivinβA启动子中发现。生物信息学分析显示,牙鲆ActivinβA和βB表达受到多种潜在因子的调控,二者在调控上有所差异。     

鲤胰岛素样生长因子结合蛋白-2和-3基因启动子克隆与序列分析

胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,IGFs)系统对鱼类的生长和繁殖有着重要的作用。利用PCR方法克隆获得了鲤胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding protein,IGFBP)-2和-3基因的上游启动子部分序列,长度分别是1142bp和1067bp。Igfbp-2启动子区域没有TATA框和CAAT框。同时,Igfbp-3中只含有TATA框,但没有CAAT框。研究结果表明,二者启动子不具备典型的启动子特征,同时,在二者启动子上还发现了cAMP应答元件和肝细胞核因子结合位点,以及Pit-1、Oct-1、RXR和GR等结合位点。研究认为,鲤Igfbp-2和-3基因的表达受到潜在的多因子调控。     

缩骨鲫MSTN基因的克隆与组织表达分析

采用同源克隆、生物信息学方法及荧光定量PCR(Real-time PCR)对缩骨鲫(Carassius auratus sogu var.)肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因进行克隆,分析和组织表达状况研究。结果显示:缩骨鲫基因组MSTN基因全长4 737 bp,含有两个内含子和三个外显子;编码区长度为1 128 bp,编码375个氨基酸,包括信号肽(1aa~23aa),TGF-β前肽保守区域(34aa~256aa),TGF-β功能区(281aa~375aa),保守的RXXR蛋白酶酶切位点以及C-端活性区域9个保守的半胱氨酸残基,这与其他物种MSTN相似。此外,缩骨鲫与鲫鱼(Carassius auratus)的MSTN氨基酸序列同源性最高,达到96.1%。以β-actin为内参基因,荧光定量PCR分析表明,MSTN在肌肉中表达量最高;脑、眼、心脏中次之;在肝胰脏、卵巢、肠和肾脏中微量表达。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus) Activin 基因两种β亚基的启动子克隆及生物信息学分析

以牙鲆为研究对象,利用染色体步移(Genome walking)获得了 Activin 两个β亚基基因的上游部分启动子序列,并对其进行了转录调控元件的生物信息学预测分析。获得了 Activin βA 和βB两个亚基的启动子部分序列,长度分别约为2.7 kb 和2.4 kb;在预测的 Activin βB 转录起始位点(+1位)的上游31 bp 处有1个典型的 TATA box,而在 Activin βA 中未发现 TATA box 的存在。两个基因的启动子上发现了多个转录因子 Sp1、Oct-1、C/EBP、CREB、GATA-1、HNF-3、HNF-1、USF 等结合位点,还发现了与内分泌相关的 Pit-1、ER、PR、GR、RAR、RXR 等结合位点,但肌性转录因子 MyoD、myogenin 和雄性的性别决定基因 SRY 结合位点仅在 Activin βA 启动子中发现。生物信息学分析显示,牙鲆 Activin βA 和βB 表达受到多种潜在因子的调控,二者在调控上有所差异。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus) Activin基因两种β亚基的启动子克隆及生物信息学分析

以牙鲆为研究对象,利用染色体步移(Genome walking)获得了Activin两个β亚基基因的上游部分启动子序列,并对其进行了转录调控元件的生物信息学预测分析。获得了Activin βA和βB两个亚基的启动子部分序列,长度分别约为2.7 kb和2.4 kb;在预测的Activin βB转录起始位点(+1位)的上游31 bp处有1个典型的TATA box,而在Activin βA中未发现TATA box的存在。两个基因的启动子上发现了多个转录因子Sp1、Oct-1、C/EBP、CREB、GATA-1、HNF-3、HNF-1、USF等结合位点,还发现了与内分泌相关的Pit-1、ER、PR、GR、RAR、RXR等结合位点,但肌性转录因子MyoD、myogenin和雄性的性别决定基因SRY结合位点仅在Activin βA启动子中发现。生物信息学分析显示,牙鲆Activin βA和βB表达受到多种潜在因子的调控,二者在调控上有所差异。     

吉富罗非鱼 MSTN 基因结构及其多态性与生长性状的相关性

通过PCR和基因组步移法,从吉富罗非鱼DNA中扩增出肌细胞生长抑制素(MSTN)基因及其5′调控区。该序列全长2413bp,含有3个外显子,2个内含子。5′调控区462bp,外显子Ⅰ379bp,外显子Ⅱ371bp,部分外显子Ⅲ145bp,内含子Ⅰ305bp,内含子Ⅱ751bp,编码区共编码298个氨基酸。5′调控区含有与肌肉特异性基因转录密切相关的转录调控元件E-box以及其他一些转录调控元件,如TATAbox,OCT1,AP1,AP4。通过随机测序法寻找SNPs(Signal nucleotide poly morphisms),获得了3个SNPs,但在群体筛选中,只有内含子Ⅱ内的1个SNPs表现多态性。同时测量了96尾(45♂,51♀)吉富罗非鱼的体质量、体长、体高、体厚,并将这些数据与MSTN基因的SNPs多态性进行相关性分析,研究发现MSTN基因内含子Ⅱ的728nt处G/T多态与吉富罗非鱼体型(体厚/体长、体高/体长)存在显著相关(P0.05)。这些研究结果表明,MSTN基因的SNPs可作为吉富罗非鱼育种的候选分子标记。     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268～+56 bp,且-1 308～-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224～+48 bp,且+48～+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229～-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

中国明对虾FcβGBP-HDL基因和启动子的克隆及序列特征分析

FcβGBP-HDL是中国明对虾免疫应答中的一种模式识别受体,在白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)侵染后其表达显著上调.为了探讨FcβGBP-HDL在免疫应答中的转录调节机制,实验以FcβGBP-HDL cDNA为基础设计引物,采用染色体步移技术对其基因组DNA和启动子进行克隆,构建一系列缺失表达载体进行启动子活性分析.结果显示,FcβGBP-HDL基因全长6 713 bp,无内含子;启动子区域长1 507 bp,除了1个启动子核心序列、2个SRF、2个TBP、1个CTF和1个CRE等典型的启动子特征外,还有2个GATA-1、3个AP-1、1个c-Ets-1和7个Sp1等参与其它节肢动物免疫基因转录调节的结合位点;同源比对分析表明,FcβGBP-HDL启动子与FcCTL启动子相似度最高(41.4％);不同长度的启动子片段具有不同的启动荧光素酶报告基因表达的活性,其中去除5 '端2个AP-1后的启动子片段具有最高的启动活性,去除启动子核心序列的启动子片段启动活性最低.研究表明,FcβGBP-HDL启动子可能在免疫反应中受到调节.