棉花GhRGL基因克隆及其原核表达研究

GA信号转导途径是通过DELLA蛋白来抑止的。通过对Genbank进行Blast比较,我们首次克隆了棉花DELLA蛋白基因,长度为1644bp,分离的棉花DELLA蛋白进行生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥中的DELLA蛋白一样的保守结构域,我们对克隆的基因进行原核表达研究,将克隆的基因转化原核表达载体pET22b,在E.coli BL21（DE3）菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhRGL蛋白, 大小约为64kDa。首次实现了棉花DELLA蛋白基因在原核系统中的表达, 为棉花DELLA蛋白的抗体制备及其表达定位研究奠定了基础。     

毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3的基因克隆和原核表达分析

为研究毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3的酶学特征和生理功能,本实验对PtCP3进行了基因克隆和原核表达分析。从毛果杨(Populus trichocarpa Torr.Gray)中克隆得到半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3,将其克隆至pMD-18T载体。进一步构建原核表达载体pET30a-PtCP3,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功诱导表达重组蛋白,然后通过包涵体洗涤法对目的蛋白进行纯化。测序结果表明,PtCP3基因CDS序列全长1074 bp,含有木瓜蛋白酶的保守催化位点和组织蛋白酶B的保守结构域。序列分析结果显示,半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3编码357个氨基酸,预测N-末端含有长度为27个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽后蛋白酶大小为36.515 kDa,理论等电点为7.44。SDS-PAGE电泳结果显示,可以检测到大小约为42 kDa的目的条带,并可通过包涵体洗涤法在体外得到了高表达量、单一的重组蛋白PtCP3。     

黄瓜CsRAX2的克隆与表达分析及原核表达蛋白诱导

作为最大的转录因子家族,MYB转录因子广泛参与植物的生长发育以及对胁迫的响应与耐受。CsRAX2是黄瓜MYB转录因子家族成员之一,本研究通过同源克隆法克隆了CsRAX2全长,分析了该转录因子基因的生物信息和表达特征,在原核表达系统中诱导并纯化该蛋白。结果表明,CsRAX2全长939 bp,编码321个氨基酸,定位在3号染色体。CsRAX2蛋白定位在细胞核,与其他物种MYB的进化关系很近,是一个典型的R2R3-MYB转录因子。CsRAX2表达具有组织特异性,且低温处理显著诱导采后黄瓜CsRAX2表达,表明其可能在采后黄瓜低温反应调控中发挥作用。启动子元件分析显示,该基因启动子中含有多个环境和激素响应元件,表明非生物胁迫可能通过激素信号调控CsRAX2表达。原核表达研究表明,培养温度影响原核表达蛋白的诱导效果,降低细菌培养温度能提高上清液中融合表达蛋白产量。本研究结果为进一步研究黄瓜CsRAX2基因的生物学功能及黄瓜耐冷性机理提供了帮助。     

拟南芥未知基因At018融合蛋白原核表达条件的优化及纯化

本课题组在前期的研究中利用Al Cl3胁迫筛选碱茅全长c DNAs酵母表达文库获得到一个与铝毒害相关的未知基因(基因编号为018,用put018表示),该基因与拟南芥中未知基因(基因号为At5g57345,本研究中用At018表示)有较高的同源性。为了获得At018的纯化蛋白,本研究将拟南芥At018基因克隆后构建原核表达载体p GEX-6p-3-At018,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。同时运用传统方法优化诱导条件,以提高重组融合蛋白的表达效率。SDS-PAGE分析结果表明,30℃下0.1 mmol/L IPTG的条件下诱导3 h后,GST-At018融合蛋白的表达量最大,蛋白分子质量与预测值相符,该蛋白主要以可溶性形式存在;接着利用Glutathione Sepharose4 Fast Flow亲核层析树脂纯化最终获得GST-At018融合蛋白。本研究可为进一步进行At018的功能解析提供基础。     

棉花GhCOMT3基因的原核表达、纯化及鉴定

为了深入研究GhCOMT3基因的功能,将GhCOMT3基因构建到原核表达载体pET-28a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用0.2mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,结果发现,16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达;30℃诱导的蛋白表达量最大,之后对包涵体进行变性溶解,进行SDS-PAGE检测,再经过蛋白标记亲和层析柱(His TrapTMHP)纯化得到变性的pET-28a-GhCOMT3融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化效果,鉴定表达产物,目的蛋白相对分子量约为39.119kDa,检测结果与预期一致。结果表明,pET-28a-GhCOMT3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达产物,为在蛋白水平上研究GhCOMT3基因功能奠定了基础。     

阳春砂WRKY40的克隆、分析及原核表达

转录因子可有效调控植物次生代谢产物的生物合成,本研究从姜科药用植物阳春砂(Amomum villosum Lour.)中克隆获得两个WRKY转录因子基因,命名为AvWRKY 40-1和AvWRKY 40-2。两个基因的编码框分别为852 bp和885 bp,分别编码283和294个氨基酸。Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2编码的蛋白序列一致性为75%,在GenBank中均比对上拟南芥的WRKY 40,且均含有WRKY转录因子家族所共有的WRKKYGQK七肽序列及CX5CX23HNH锌指结构域。系统发育进化树表明:Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2与菠萝(Ananas comosus)的AcWRKY 71亲缘关系最近,且与单子叶植物的WRKY聚为一支。两个基因在阳春砂果皮和种子团中的表达有差异,并且与阳春砂转录组中筛选出来的萜类合酶基因表达相关性也存在差异,AvWRKY 40-1表现出与萜类合酶基因更高的相关性。成功构建了两个基因的重组表达载体pDEST 17-Av WRKY 40-1和pDEST 17-Av WRKY 40-2,经诱导表达得到其融合蛋白。本研究首次克隆阳春砂的WRKY类转录因子基因并获得其融合蛋白,为后续Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2的功能鉴定及其对萜类的代谢调控研究提供基础。     

拟南芥抗病相关基因T1N6_22的原核表达分析

为构建拟南芥抗病相关T1N6_22基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的T1N6_22蛋白,以拟南芥Col-0的c DNA为模板,扩增获得了T1N6_22基因CDS,对其进行克隆、测序后与含有GST标签蛋白的p GEX4T-1载体相连,构建T1N6_22的原核表达载体p GEX4T-1-T1N6_22-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的载体及空载体转化大肠杆菌BL21。结果表明,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与标签蛋白融合的T1N6_22蛋白,大小约57 k Da。SDS-PAGE分析表明,高效表达的诱导条件为0.1 mmol/L IPTG诱导培养3 h。研究结果为进一步T1N6_22互作蛋白的筛选及其调控拟南芥抗病分子机制的研究奠定了基础。     

番茄褪绿病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达

为制备番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)抗血清,以番茄病叶为试验材料,提取总RNA,根据To CV CP基因设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,构建原核表达载体p ET32a-To CVCP,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达CP蛋白。结果表明:To CV CP基因(Gen Bank登录号:KT809400)全长774 bp,编码257个氨基酸,与Gen Bank中其他地区分离物核苷酸序列同源性为97.2%~99.6%,推导的氨基酸序列同源性为97.3%~100.0%。核苷酸序列保守位点占全部位点的91.3%,氨基酸序列保守位点占全部位点的88.3%,表明不同地理来源的番茄褪绿病毒的CP基因保守性较高。将To CV CP基因克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,转p ET32a-To CVCP载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达了分子量约33 k Da的重组蛋白。该重组蛋白在37℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导6 h,表达量最大。     

人源白细胞介素(h-IL2)基因克隆及原核表达的研究

构建人源白介素(h-IL2)基因的表达载体,并尝试在原核细胞中诱导表达,以用于进一步重组蛋白纯化和抗体生产.以h-IL2基因为模板,采用PCR技术扩增h-IL2基因,连接到pMD-18T载体中构建克隆载体,转化到感受态DH5α,提取质粒PCR、双酶切验证连接成功,经DNA测序鉴定基因序列与GenBank数据库收录h-I...     

抗凋亡融合蛋白PTD-Bcl-xL原核表达载体的构建及表达纯化

人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-x L能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-x L与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为c DNA,设计引物以c DNA为模板,PCR扩增Bcl-x L基因,构建p UM19-T-Bcl-x L质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-x L引物,以测序正确的p UM19-T-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-x L序列,将扩增序列克隆入p ET28a载体,构建PTD-Bcl-x L蛋白的原核表达质粒p ET28a-PTD-Bcl-x L,并对p ET28a-PTD-Bcl-x L载体双酶切鉴定和测序鉴定;将p ET28a-PTD-Bcl-x L重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切p UM19-T-Bcl-x L质粒出现约774 bp大小条带,p UM19-T-Bcl-x L质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建p UM19-T-Bcl-x L质粒;双酶切p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒出现约744 bp大小条带,p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p ET28a-PTD-Bcl-x L原核表达载体;在IPTG诱导下p ET28a-Bcl-x L重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 k Da大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-x L蛋白。纯化得到了PTD-Bc L-x L融合蛋白,推进了PTD-Bcl-x L蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。     

鸭梨苹果茎痘病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达

为了进一步明确苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)的分子变异及株系分化,制备相应特异性抗血清.本研究以库尔勒地区种植的感染ASPV的鸭梨(Y)枝条韧皮部为试材,采用RT-PCR技术扩增ASPV CP基因,克隆、测序,获得了鸭梨分离物外壳蛋白(ASVP CP-Y)基因,将该CP基因连...     

马铃薯转录因子StTCP13基因的原核表达及盐胁迫功能研究

初探StTCP13基因在盐胁迫方面的功能,为StTCP13在马铃薯非生物逆境响应的功能研究奠定基础.采用同源克隆策略获得StTCP13基因编码区全长,利用生物信息学分析蛋白结构域并构建系统进化树,qRT-PCR技术分析该基因表达模式,双酶切法构建StTCP13-pGEX6P1原核表达载体,利用大肠杆菌BL21表达StT...     

杜仲Dirigent1基因的原核表达及蛋白纯化

植物Dirigent蛋白认为指导木脂素和木质素的生物合成,同时在生物防御应答,次生代谢调控和病原体抗性的过程中起到了重要的作用。本研究以实验室前期克隆得到杜仲Dirigent1基因(EuDIR1)为基础,利用基因重组技术构建pET-30a-EuDIR1原核表达载体。重组载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)中,在15℃下0.1 mmol/L异丙基硫代β-D-半乳糖苷诱导6 h后,蛋白的沉积量达到最高值,表达模式主要为包涵体。对包涵体进行溶解,使用镍-亚氨基二乙酸亲和层析柱进行纯化。收集纯度较高的洗脱组分进行透析复性,并用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot鉴定重组蛋白。结果表明,成功构建了pET-30a-EuDIR1原核表达载体,表达菌株诱导后在相对分子质量约18 kD处有1条特异性蛋白条带,包涵体纯化、复性后,经Western Blot鉴定,获得可溶性且纯度较高的重组蛋白。实验中得到的EuDIR1蛋白为体外生化实验提供了科学依据。     

葡萄分枝基因VvBRC3截短蛋白的原核表达条件优化

为优化葡萄分枝基因VvBRC3的原核表达条件,本研究分析了该蛋白的基本理化性质、二级结构、稀有密码子和蛋白质结构模型等生物信息学特性,将克隆得到的VvBRC3全长序列和含有TCP、R结构域的截短序列均连接至pET30a和pGEX4T-1载体,构建得到四种原核表达载体。从诱导剂浓度、诱导时间(终OD_(600)值)、初始菌体OD_(600)值、诱导温度4个方面对截短基因表达条件进行优化。结果表明:Vv BRC3蛋白含有376个氨基酸,理论等电点为6.51,属于不稳定蛋白,含有TCP结构域、R结构域,具有螺旋-环-螺旋的结构特征,且稀有密码子较多。但VvBRC3全长基因无法表达,截短基因可以表达且截短蛋白可溶。菌体密度OD_(600)为0.3时,加入0.1 mmol/L的IPTG,于16℃下诱导至终OD_(600)为1.2～1.4,是该截短基因的最佳表达条件。本研究成功构建了截短的VvBRC3原核表达载体,并优化其表达条件。     

APEC毒力基因ygeG的原核表达载体构建、表达纯化及鉴定

兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室前期预测了新的ETT2伴侣分子YgeG,为了获得大量有活性的YgeG蛋白,对其功能进行鉴定,并筛选出与其相关的具有活性的ETT2分泌效应蛋白,将对目的蛋白原核表达条件进行优化。以禽致病性大肠杆菌菌株81(AE81)为模板对基因ygeG进行扩增,将扩增产物克隆至pGEX-6p-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6p-1-ygeG,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化。SDS-PAGE及Western Blot鉴定结果显示,本试验中表达的最佳条件为:IPTG终浓度为0.25 mmol/L,16℃诱导16 h。重组蛋白大小约为44 ku,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达,主要以可溶性蛋白的形式存在,并且具有良好的免疫原性和反应原性。成功表达了AE81-YgeG蛋白,为该蛋白的结构和功能及ETT2的深入研究奠定基础,为禽大肠杆菌病的防治提供理论依据。     

拟南芥TCP家族转录因子At2g31070的转录激活活性鉴定与表达谱分析

TCP家族转录因子是植物所特有的转录因子家族,它主要在分生组织中起作用,与细胞分化和生长有很大联系。我们以哥伦比亚野生型拟南芥为模板得到基因At2g31070的全长ORF,生物信息学分析结果表明它具有TCP家族保守结构域,属于TCP家族的转录因子。以拟南芥成株不同组织的RNA为模板进行RT—PCR实验,结果发现较之其它组织,该基因在花中有比较高的表达量;通过酵母单杂交实验鉴定该基因具有转录激活活性。综合以上结果,我们认为At2g31070基因在拟南芥花形成发育的过程中发挥转录因子的作用,在一定程度上调控和影响了这个过程。     

拟南芥花组织高表达TCP家族转录因子Atlg30210的克隆与转录激活活性鉴定

本文从拟南芥中克隆到基因Atlg30210的全长读码框。多序列比对结果表明，在推导的氨基酸水平上，该基因编码的蛋白含有特征性的TCP保守结构域，与已知的玉米、金鱼草和水稻的TCP家族基因中都存在显著性的保守性。另外通过酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内具有转录激活功能。同时RT—PCR实验结果表明，该基因在拟南芥花组织中表达量相对较高，具有明显的组织表达特异性。花器官高表达转录因子的克隆将为研究TCP基因调控植物花发育和花形态建成提供新的物质基础。     

杜仲EuGT2基因的原核表达及蛋白纯化

本研究以克隆所得杜仲(Eucommia ulmoides)EuGT2基因为基础,利用基因重组技术构建原核表达载体pMCSG19-EuGT2。重组载体转化到E.coli Rosetta(DE3)中,用0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导6 h。使用镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱进行纯化,并用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳进行检测。研究结果表明,杜仲EuGT2基因在E.coli Rosetta(DE3)中得到成功表达,重组蛋白表达形式为部分包涵体、部分可溶性蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳检测,在相对分子质量约56 kD处有1条特异性蛋白条带,经质谱鉴定该特异性蛋白条带确为杜仲EuGT2蛋白。以上研究结果为后续研究杜仲糖基转移酶的功能提供了科学依据。     

绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值，以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值。它是一种多活性的物质，不同RIP具有各自独特的功能，其潜在活性还在不断发现之中。葫芦科(Cucurbitaceae)植物大多药食同源，其中蕴涵着极其多样的RIP，但多数已知的RIP其基因尚未被克隆，而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法。葫芦科中的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效，其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道，但．其活性蛋白成分未见报道。为此，本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究。率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究，从中分离到一种新的核糖体失活蛋白(绞股蓝毒蛋白，Gynostemmin)。它具有很高的抗TMV活性。其分子量约为27kDa。测得其N-端19个氨基酸序列：DINFSLAGADGQTYNTFIA，与其它植物RIP的同源性为10％一73％，与葫芦科RIP的同源性为37％一73％。根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对LYl／LY2，对基因组DNA进行PCR扩增，首次建立了RIP新基因快速筛选体系。从冬瓜和南瓜中分别获得了1个和5个RIP新基因，长度为408bp，编码136aa，与其它葫芦科RIP对应区段的同源性约为35％一85％。比较发现，19个葫芦科RIP的LYl／LY2区段上完全相同的氨基酸有29个，其中7个在其它科属来源的RIP中也完全保守，包括构成活性中心的3个残基E160、R163和W192。根据LYl／LY2区段同源性构建的系统进化树表明，葫芦科RIP之间的进化关系与其来源植物间的亲源关系大体一致。通过DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆，从绞股蓝中分离了13个RIP基因，其中10个为cDNA序列，3个是DNA序列(GP609、DNA-750和DNA-8001)。它们之间在碱基水平和氨基酸水平上的同源性都很高，可根据序列上发生缺失的有无及其类型将其分为4组：组1，发生6bp缺失(535 GAAAAC 540，与574-579间的序列完全一样)，包括GynostemminⅡ、GP609和CX8405A，编码275aa；组2，缺失87bp(122-208)，包括DNA-750和CX820，编码248aa；组3，包括5RACE和DNA-8001，不发生组2的87bp缺失，但因其序列较短，无法确认是否具备组1的6bp缺失；组4，包括GynostemminⅠ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ以及EMUZW和RHXJB，既无87bp缺失也不发生6bp缺失，编码277aa。其中GP609与其它葫芦科RIP的LYl／LY2区段的同源性，碱基水平为47％-61％，氨基酸水平为37％-49％。5RACE中包含了由23aa组成的信号肽“MRVARFCTVVAILLYFGFHIAEC”，同时包含有5’UTR序列，其中含有kozak序列“AAAAA”。对绞股蓝RIP基因家族及其编码氨基酸进行的比较分析发现，绞股蓝RIP前体成熟过程中可能发生C-末端切除，并因此造成等电点从弱酸性跃迁至强碱性，这种现象以前未见报道。分析结果进一步支持了RIP基因无内含子的观点。5个含有3’UTR的成员中，GynostemminI比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件ARE(AU-rich element)，其mRNA的稳定性可能因此受到影响。运用生物信息学软件对绞股蓝RIP前体进行碱基组成和密码子偏倚性、氨基酸组成特征、功能位点、亚细胞定位、跨膜结构、核酸结合基序以及空间结构等方面的分析。分别将GP609和RHXJB转入pGEx-2T融合表达载体，在大肠杆菌DH5a菌株中实现融合表达。将DNA-8001连接到pET-5a表达载体上，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中实现天然表达，表达产物对TMV的抑制效果很差，其原因可能是C-末端延伸序列的存在抑制了抗TMV活性的发挥。分别构建了含有GP609和EMUZW的pEmu-mcs-N植物表达载体，同时构建了含有RHXJB的pKYLX71：35S^2植物表达载体(ZW-pK)。采用三亲交配法将ZW-pK转入土壤农杆菌LBA4404中，用于转化烟草品种K-326，分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录。重点讨论了绞股蓝RIP的应用前景、RIP基因的内含子、以及RIP的C-末端及其延伸序列的修饰和功能等方面的问题。研究结果为绞股蓝RIP的开发利用奠定了坚实基础，并对探讨其酶学活性、生理功能以及抗病毒机理等RIP研究的难点和热点问题具有一定的指导意义。