猕猴桃EST序列的SSR信息分析

从NCBI公共数据库中最新公布的猕猴桃表达序列标签（Expressed Sequence Tag,EST）中随机抽取56,400条序列,应用SSRHunter软件查找微卫星（Microsatellite,SSR）重复序列。研究结果表明,从猕猴桃EST序列中获得了7939条SSR,其中包括二核苷酸重复5131条（64.63%）,三核苷酸重复1237条（15.58%）,四核苷酸重复284条（3.58%）,五核苷酸重复397条（5.00%）, 六核苷酸重复890条（11.21%）。大约每2.48kb 长度的单一基因序列中即存在1个SSR, 即平均7个单一基因中存在1个SSR。二核苷酸重复序列是最丰富的重复单元,其次为三核苷酸重复和六核苷酸重复。在所获得的SSR重复单元中,AG/CT为优势重复,共分布4654条（90.70%）。通过筛查猕猴桃EST序列中的SSR,可为猕猴桃基于EST-SSR的分子生物学研究奠定理论基础。     

小麦黄花叶病毒罗田分离物28kD蛋白基因的克隆及序列分析

通过RT－PCR，获得了小麦黄花叶病毒罗田分离物28kD蛋白基因的cDNA克隆pUW28-10。序列分析结果表明，小麦黄花叶病毒不同分离物的28kD蛋白基因的核苷酸序列存在一定的差异：湖北罗田和河南潢川分离物在第326，327和336位较四川雅安、江苏扬州及日本分离物缺少3个核苷酸（nt)，前两者核苷酸长度为762nt，后三者为765nt；不同分离物核苷酸序列同源性从92．1％到96．9％，相应的氨基酸序列同源性从89．8％到97．3％。     

拟南芥逆境胁迫诱导表达基因rd29A启动子的克隆与序列分析

以拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到逆境胁迫诱导表达基因rd29A的启动子片段,将其克隆到pUC19质粒中进行序列分析。结果表明,获得的启动子片段大小为937bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸序列同源性为99．8％。     

水稻26kDa球蛋白基因启动子克隆及序列分析

以水稻品种日本晴基因组总DNA为模板,采用PCR扩增获得约900bp大小的DNA片段,回收该片段并与pUCm-T载体连接,转化感受态大肠杆菌.进行PCR检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含904个核苷酸对;采用vector NTI软件将本试验中克隆的序列与Genbank（AY427575）公布的日本晴球蛋白基因启动子序列比对,有9个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻球蛋白基因启动子;在重要功能区段上,两者核苷酸序列完全一致.本研究认为造成长期不在一个环境中种植的同一水稻品种球蛋白基因启动子序列差异的原因之一,可能是核苷酸中性突变.水稻球蛋白基因启动子的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.     

虎纹蛙皮肤组织cDNA文库的构建及抗菌肽基因tigerinin-HRs的克隆

运用SMART技术成功构建了虎纹蛙(Hoplobatrachus rugulosus)皮肤组织全长cDNA文库。根据蛙科动物抗菌肽的信号肽保守序列设计简并引物,以PCR法成功从文库中随机挑选的阳性克隆中筛选出2个抗菌肽cDNA序列,命名为tigerinin-HR1和tigerinin-HR2。这2个抗菌肽cDNA序列是首次从虎纹蛙皮肤组织中克隆出的抗菌肽编码基因。     

牙鲆肝脏抗菌肽-2基因序列和表达分析

抗菌肽是鱼类先天免疫的组成部分,发现新的抗菌肽对于动物抗病机理的研究和寻找新药物有重要意义。经过对GenBank数据库中牙鲆EST文库进行同源比对后,筛选得到一个具有完整编码框的抗菌肽cDNA序列,结果再经过RT-PCR进行验证,命名为LEAP-2,对该序列进行注释,获得序列登录号EU586111。该抗菌肽能编码102个氨基酸的多肽,前28个氨基酸组成信号肽。推测编码蛋白质分子量为11 276.9 u,理论等电点(PI)为9.33。其蛋白质序列与另外9种鱼类的同源抗菌肽序列比较发现,同源性介于38.2%～61.7%。其中57至92位氨基酸为高度保守区,是维持其空间结构的主要区域,其中包含有4个保守的半胱氨酸,可能组成2个二硫键。荧光定量PCR分析显示,LEAP-2基因在肝脏中高表达,在牙鲆仔鱼不同发育时期中也有表达,但是表达水平存在明显差异,特别是在变态中期表达量比较高。     

转抗菌肽基因辣椒株系的青枯病抗性鉴定及系统选育

利用通过农杆菌介导技术获得的T0代转抗菌肽基因辣椒植株为试材,对其自交株系世代群体连续进行抗青枯病鉴定筛选、分子生物学检测和系统选育,首次获得了具有抗青枯病能力的转抗菌肽基因辣椒稳定株系。同时,对其主要果实性状、青枯病抗性进行的对比试验结果表明,转抗菌肽辣椒株系除抗青枯病能力明显提高外,果实性状基本不变。上述结果显示,外源目的基因主要特性的遗传是稳定的、表达是忠实的,从实践上验证了转抗菌肽基因工程操作的实用性。     

种子特异表达启动子的克隆分析及其植物表达载体的构建

根据GenBank已公布的种子特异性的Oleosin蛋白基因启动子序列设计合成引物,利用PCR技术从油菜总基因组DNA中扩增出Oleosin基因启动子序列(SOP),将该序列克隆到pGM-T载体中,经鉴定获得pGM-T-SOP重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由899 bp核苷酸组成,其核苷酸序列与GenBank中的Oleosin基因启动子序列同源性高达95.6%。分别用限制性内切酶HindⅢ和BamH I双酶切重组质粒pGMT-SOP和双元植物表达载体pBI121,分别回收pGMT-SOP重组质粒中的SOP小片段和pBI121植物表达载体中去掉CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定,获得由SOP驱动报告基因GUS的新型植物表达载体pBI121-SOP,为外源基因在油菜种子中的定位表达研究奠定基础。     

猪HK2基因的克隆及序列分析

为克隆猪己糖激酶2基因,分析其生物功能,采用已报道的人及小鼠HK2的cDNA序列为依据,利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物,扩增新的猪HK2基因cDNA序列。将PCR产物克隆测序,分析获得的核苷酸序列及其编码蛋白的特性,分离的开放阅读框全长2754bp,编码917个氨基酸,与人和小鼠的核苷酸序列同源率分别为90%和87%,与人和小鼠的氨基酸序列同源率分别为96%和94%,利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其蛋白结构,为进一步开展猪HK2基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

无核荔枝生长素反应因子基因克隆及序列分析

为获得在无核荔枝中胚珠退化过程中差异表达的生长素反应因子基因(ARF),对其全长的克隆并进行分析,根据构建的无核荔枝胚珠败育SSH消减文库的生长素反应因子EST序列,提取高质量的RNA,通过SMART-RACE技术,获得一个生长素反应因子3501 bp的核苷酸序列。应用生物信息学软件进行分析,预测该序列含有2550 bp的开放阅读框,推导的蛋白质为849个氨基酸,具有B3、Auxin_resp和AUX_IAA保守区与结构功能域。分析表明该基因为ARFs基因家族中的一个新成员,进化树上与芒果亲缘关系最近。     

逆转录病毒介导的天蚕抗菌肽B在奶牛乳腺中的表达

摘要：为了研究天蚕抗菌肽在奶牛乳腺组织较长期表达的可行性及对天蚕抗菌肽对大肠杆菌的抑制作用,将天蚕抗菌肽B(cecropin B,CB)的基因序列,以哺乳动物偏爱的密码子优化后,设计合成了四条相互重叠的DNA片段,通过重叠延伸PCR法合成了天蚕抗菌肽B的基因,亚克隆至T载体,测序正确后构建逆转录病毒载体pLNCX-bCP-cecB,经过包装细胞的包装,获得含有天蚕抗菌肽B表达框的逆转录病毒,注射入奶牛乳腺组织,通过琼脂板孔穴扩散法检测基因的表达及活性;实验结果表明,克隆的抗菌肽基因在乳腺中获得了表达,表达产物对大肠杆菌具有抑制作用,抑制效果可以持续至13天以上。     

广东湛江杂草稻qSH1基因片段序列分析

摘要：为了探讨杂草稻与栽培稻在qSH1基因片段是否存在差异。利用已经报道的扩增水稻qSH1基因的引物,对来源于广东湛江雷州地区的6份落粒性非常强的杂草稻进行PCR检测,通过测序得到约460bp的核苷酸碱基序列,序列分析结果表明：该核苷酸碱基序列大致位于qSH1基因下游100kb处,与NCBI网站公布的核苷酸序列为同源序列,同源性达100 %。这6份杂草稻与水稻之间共同存在一个碱基位点差异,经证实正是前人报道的SNP位点。另外6份杂草稻所获片段序列不完全一致,存在一个位点差异,但不能确定是否为一个作用位点。     

龙眼胚性愈伤组织肌动蛋白基因(actin)片段的克隆与序列分析

采用同源克隆方法从龙眼胚性愈伤组织分离肌动蛋白基因（actin）。通过保守区和3’RACE扩增,分别获得347bp和837bp的特异片段,经过序列拼接得到895bp的龙眼actin基因3’端序列。与多种植物的肌动蛋白基因进行同源性比较,该片段的核苷酸序列同源性多在80%以上,氨基酸序列同源性大于90%,具有高度保守性。可作为龙眼体胚发生过程中基因表达分析的内参。     

CRISPR/Cas9技术在获取双突变体材料中的应用

为了研究含双MATH结构域基因sb3 与sb6 的功能,需要创制这2 个紧密连锁基因的双突变体。利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对拟南芥Col-0 中的sb3、sb6 基因进行特异性定点双敲除。通过PCR和Singer 测序验证,共获得10 株T0代转基因植株,其中5 株在目标片段上没有发生编辑;另5 株在sb3 基因上的目标序列都发生了编辑,在sb6 基因的目标序列上只有2 株发生了编辑。至此成功获得了sb3 与sb6 基因双敲除的突变体,且获得该突变的类型为核苷酸缺失突变体。这个双突变体的获得为进一步研究双MATH结构域基因在拟南芥中的功能奠定了良好的基础     

草莓ABA结合蛋白基因的克隆及序列分析

为进一步研究ABA结合蛋白在草莓抗逆性方面的作用,本文通过CTAB法提取五叶草莓总DNA,根据NCBI数据库中的ABA结合蛋白受体的基因序列信息,设计特异引物,克隆得到4426 bp的ABA结合蛋白基因。序列分析表明该基因全长4662 bp,编码1393个氨基酸,核苷酸序列比对表明,该序列与GenBank中其他物种的CHLH序列有极高的同源性,核苷酸序列比较相似率在77%~90%,氨基酸相似性在63%~73%。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63负调控基因nsdAmgh的克隆及序列分析

nsdA (Negative regulator of Streptomyces differentiation)基因是天蓝色链霉菌中发现的与抗生素合成相关的负调控基因.根据天蓝色链霉菌 A3(2)的序列设计引物扩增玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 菌株中的该基因,经测序和序列分析表明,由保守序列引物nsdA-2R和nsdA-2L克隆到的Men-myco-93-63 菌株中的该基因 800 bp片段与已知nsdA基因核苷酸保守区域序列同源性达到99%,由全长序列扩增引物nsdA WZ-R和nsdA WZ-L克隆到的该基因包含一个完整的开放阅读框,共编码 369 个氨基酸,与变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌A3(2)中的nsdA 基因的核苷酸序列同源性达到100%,氨基酸序列同源性达到99%.该全长基因命名为nsdA_(mgh),其在玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 中的发现为阻断该负调控基因以期获得抗生素高产工程菌株提供了重要依据.     

CRISPR/Cas9技术在获取拟南芥双突变体材料中的应用

为了研究含双MATH结构域基因sb3与sb6的功能,需要创制这2个紧密连锁基因的双突变体。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥Col-0中的sb3、sb6基因进行特异性定点双敲除。通过PCR和Singer测序验证,共获得10株T0代转基因植株,其中5株在目标片段上没有发生编辑;另5株在sb3基因上的目标序列都发生了编辑,在sb6基因的目标序列上只有2株发生了编辑。至此成功获得了sb3与sb6基因双敲除的突变体,且获得该突变的类型为核苷酸缺失突变体。这个双突变体的获得为进一步研究双MATH结构域基因在拟南芥中的功能奠定了良好的基础。     

大白菜DREB类转录因子cDNA的克隆及植物表达载体的构建

以干旱处理的大白菜自交系85-1为材料,利用RT-PCR技术获得了大白菜DREB类转录因子基因的cDNA编码序列,命名为BcDREB1(GenBank登录号为:EU924266).序列分析表明,BcDREB1核苷酸序列长663 bp,编码214个氨基酸,含有一个典型的AP2结构域,具有DREB转录因子的典型特征.将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301中,成功构建了大白菜BcDREB1基因的植物表达载体pCAM-BcDREB1,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础.     

基于公共数据库的西瓜EST-SSR信息分析与标记开发

为了给西瓜遗传基础研究提供新的共显性分子标记,对公共数据中的8619条西瓜EST序列进行处理和分析,获得202个EST-SSR,分布在191条EST序列中,出现频率为2.31%,分布密度为1/19.1kb.其优势重复基序为二核苷酸和三核苷酸(68.8%),在二核苷酸基序中以AG/TG类型为最多(46%);在三核苷酸基序中,以AAG类型为最多(43%).基序重复次数以4次(17.8%)、7次(15.3%)和11次(14.9%)为最多.长度主要分布在20～30 bp(76%).利用上述EST-SSR序列设计获得24对引物在西瓜白化致死近等基因系中进行验证,结果获得了16对有效的扩增引物,占总设计引物对数的66.7%.结果表明:利用公共数据库中的EST序列开发西瓜EST-SSR标记是一种有效的方法.     

西瓜和黄瓜乙烯受体ETR1基因片段的克隆与序列比较分析

乙烯受体基因ETR1是乙烯信号转导过程中的关键调控基因.研究根据ETR1基因的保守序列设计引物,以西瓜(Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nadai var.lanatus)和黄瓜(Cucumis sativus L.)的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得序列长度分别为1 633 bp和1 491 bp的基因片段CLETR1和CSETR1.序列分析表明,CLETR1和CSETR1与Genebank中收录的多条ETR1基因的核苷酸序列同源性在80%～98%,氨基酸序列同源性在75%～98%.西瓜和黄瓜ETR1基因片段的编码序列存在明显的单核苷酸变异,共23个核苷酸位点存在SNPs(Single nucleotide polymorphisms),其中5个SNPs导致4个编码氨基酸的改变.