猪环曲病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

为了解四川地区猪环曲病毒(PToV)的发病状况,针对PToV的保守区域S基因设计了一对特异性引物,建立检测PToV的RT-PCR方法,并对其敏感性、特异性和重复性进行了检测。结果显示,仅猪环曲病毒阳性模板可扩增得到约569bp大小的目的条带。敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸含量为15pg。对采集于12个猪场27个腹泻样本和29个临床健康的样品进行了检测。结果显示,腹泻样本中检出率为33.3%(9/27),而在健康样本中检出率为6.9%(2/29)。以上结果表明本研究成功建立了一种敏感度高、特异性强、重复性良好的用于PToV的RT-PCR方法。     

猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立

本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术。利用建立的CSFV-PEDV双重RT-PCR核酸检测技术,对某规模化猪场病料进行检测,结果表明,扩增出大小约311 bp和501 bp大小的特异性条带,为猪瘟与猪流行性腹泻病毒混合感染。建立的CSFVPEDV双重RT-PCR核酸检测技术具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,该方法的建立为CSFV和PEDV的快速诊断、疫情监测及流行病学研究奠定了基础。     

牛环曲病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立牛环曲病毒快速检测方法,针对牛环曲病毒的保守区域S基因设计合成1对特异性引物,建立了检测牛环曲病毒的RT-PCR方法,并对其进行了敏感性、特异性和重复性检测。结果显示,仅牛环曲病毒阳性模板扩增得到698 bp大小的目的条带,测序结果与GenBank中牛环曲病毒S基因序列(登录号:MG957145.1)的同源性为97%。敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸含量为1.36×10~4 copies/μL。利用该方法对采集自河南省部分地区的164份临床样品进行检测,结果显示牛环曲病毒的检出率为9.15%(15/164)。结果表明,所建立的牛环曲病毒RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于牛环曲病毒的临床检查和流行病学调查。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速、鉴别诊断方法,根据GenBank中已发表的2种病毒的基因组序列,选择病毒的保守基因各设计了一对特异性检测引物,建立了可以同时鉴别检测猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的双重RT-PCR方法.该方法能从猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒分别扩增出310 bp和161 bp的特异性片段,对2种病毒混合基因组同时扩增出310 bp和161 bp的特异性片段;该方法对猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;该方法最低可以检出0.2 pg病毒RNA含量.本研究建立的RT-PCR方法具有良好的敏感性、特异性、重复性,在一个PCR反应体系中就可以准确、快速鉴别检测出猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒,可以用于临床病料的快速检测.     

双重RT-PCR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIVM基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法。检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345bp)和PRRSV(520bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV2种病毒混合液的最小检出量分别为102EID50/0.1mL和103TCID50/0.1mL。应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒。证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测。     

双重RT-PGR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测.     

猪嵴病毒和猪星状病毒双重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪嵴病毒(PKV)和猪星状病毒(Ast V)的检测方法,本研究根据PKV 3D基因和Ast V ORF2基因设计了两对特异性引物,通过优化反应条件,首次建立了PKV和Ast V双重RT-PCR检测方法。该方法可以同时扩增出PKV的358 bp和Ast V的938 bp特异性片段,而对猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒及大肠杆菌等病原核酸扩增结果均为阴性,具有较强的特异性;对PKV和Ast V的最低检出量分别为1.51×106拷贝/μL和1.19×106拷贝/μL;利用该方法和单项RT-PCR方法对35份来自四川省部分猪场的仔猪腹泻病料样品进行检测。结果显示,PKV和Ast V的阳性检出率分别为80%和31.4%,两者符合率为100%。本研究建立的方法对PKV和Ast V的鉴别诊断和混合感染检测具有重要的应用价值。     

猪瘟、猪蓝耳病双重RT-PCR检测方法的建立与应用

为了方便、快速检测猪瘟和猪蓝耳病混合感染病例,试验根据GenBank登录的猪瘟病毒(CSFV)和蓝耳病病毒(PRRSV)基因序列,分别设计合成1对引物,建立检测猪瘟、猪蓝耳病的双重RT-PCR方法,并对引物浓度、退火温度进行优化。对优化后的RT-PCR方法进行特异性和敏感性试验,同时对临床样品进行检测。结果表明:采用建立的RT-CPR方法对CSFV、PRRSV进行扩增,分别扩增出508 bp和320 bp特异性片段,最佳引物浓度为0.4 pmoL/μL,最佳退火温度为55℃。采用该方法对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性乙型脑炎病毒不能扩增出任何片段,特异性良好。对CSFV和PRRSV最低核酸检出含量分别为32.4 ng和2.4 ng,具有较好的敏感性。对贵阳市某规模化猪场采集的临床疑似病料检出率为100%。说明成功建立了一种快速鉴别诊断猪瘟和猪蓝耳病的双重RT-PCR方法,该方法具有较好的特异性、灵敏性和临床应用性,为猪瘟和猪蓝耳病的快速、准确鉴别诊断和防控提供了有效手段。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的RT-PCR检测方法,根据GenBank中登录的PEDV M基因序列,设计并合成1对特异性检测引物,PCR产物为457 bp。结果显示:特异性试验,猪瘟病毒(CSFV)、大肠杆菌、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均为阴性,具有好特异性;敏感性试验,最低可检测到2.3×10-3μg/μL的PEDV DNA;126份临床上疑似为PEDV感染的病料,RT-PCR检测结果与商品试剂盒符合率为100%。表明本试验建立的PEDV RT-PCR检测方法可用于临床上PEDV感染引起的传染病病原学检测。     

CSFV强弱毒株双重RT-PCR方法的建立与应用

为了建立一种能在临床上快速鉴别猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)野毒和弱毒疫苗毒的检测方法,试验在对多株CSFV基因组序列比对分析后,选择特异保守区域设计2对引物构建CSFV强弱毒株双重RT-PCR方法,优化其退火温度,并检测该方法的特异性、敏感性及临床应用效果。结果表明:试验建立的双重RT-PCR方法能从CSFV弱毒疫苗毒和临床野毒株基因组中扩增出大小分别为447 bp和343 bp的特异性基因片段;最佳退火温度为55℃;应用该方法分别对繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)弱毒疫苗毒、猪口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗毒、猪乙型脑炎病毒(JEV)弱毒疫苗毒总RNA和猪伪狂犬病毒(PRV)灭活疫苗毒、猪细小病毒(PPV)灭活疫苗毒、猪圆环病毒(PCV)灭活疫苗毒的总DNA进行检测,均未见特异性条带,特异性好;对CSFV疫苗弱毒的最低RNA检出量为6.28 ng,敏感性高;对临床混合感染病料进行检测,能同时或单独检测到CSFV强毒和CSFV弱毒疫苗毒核酸。说明试验建立的双重RT-PCR方法特异性好,敏感性高,可用于CSFV强弱毒株的检测。     

猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。     

猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物,第1对引物扩增CSFV毒株NS2基因508bp片段,第2对引物扩增PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338bp/248bp片段,第3对引物扩增PRRSV欧洲型毒株ORF5基因614bp片段。经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV毒株和PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法。该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均无交叉反应;对CSFV和PRRSV 4种重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝/μL。对采集的106份临床疑似病料进行检测,结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份,占3.77%(4/106);CSFV阳性7份,占6.60%(7/106);PRRSV变异株阳性17份,占16.04%(17/106)。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法可以用于CSFV和PRRSV的临床快速鉴别诊断和流行病学调查。     

不同引物RT-PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的比较研究

用3对分别针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7、ORF5和ORF5的PCR引物N1/N2、AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2进行RT-PCR,检测PRRSV,从其敏感性、特异性和临床样品检出率等方面进行比较,在此基础上进一步建立一步法RT-PCR检测方法。结果显示:3对引物对PRRSV均有很高的特异性;应用N1/N2引物病毒最低检测量为7.9 TC ID50,而AdGP5.1/AdGP5.2引物和RFLP5.1/RFLP5.2引物PCR最低检测量为79 TC ID50;运用N1/N2、AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2引物分别进行RT-PCR扩增检测临床样品,PRRSV检出率分别为28/48、27/48和25/48,且用AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2引物检测的阳性样品,用N1/N2引物检测也都呈阳性。运用N1/N2引物,通过一步法RT-PCR成功地从PRRSV S1株中扩增出374 bp的目的基因片段。结果表明,用N1/N2引物扩增PRRSV目的基因,其敏感性和临床样品检出率更高,更适合临床样品PRRSV的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列,设计合成了1对特异性引物,参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4 ng和7×10-4 ng,对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测,结果PRRSV有55份阳性,BVDV有14份阳性,PRRSV和BVDV混合感染的有12份,与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。     

猪Kobu病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了对猪Kobu病毒进行快速诊断及流行病学监测,根据GenBank中公布的9条猪Kobu病毒基因组全序列,在3CD非结构蛋白保守区域设计并合成了2对特异性引物,建立了猪Kobu病毒的巢式RT-PCR检测方法,并用该方法对猪Kobu病毒DX株动物回归试验发病的25头仔猪的组织病料以及送检的72份临床样本进行检测.结果表明,使用该方法对25头发病猪内脏病料的阳性检出率为100％;对送检的72份临床样品的阳性检出率为87.5％ (63/72).该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于猪Kobu病毒的临床快速诊断及流行病学监测.     

ARV、REV与ALV三重RT-PCR检测方法的建立

根椐GenBank中已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）、禽网状内皮增生病病毒（REV）、禽白血病病毒（ALV）等3种病毒基因组序列,设计了3对分别与ARV、REV和ALV某段基因序列互补的引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术。结果表明,用这3对引物对同一样品中的ARV、REV、ALV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,可同时扩增ARV的247bp,ALV的675bp,REV的467bp的特异性片段,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10pg的ALV、1pg的ARV和10pg的REV模板。用42份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为92%以上。表明建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型 (porcine circovirus type 2,PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV 的VP2、PRV的 gD、和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了3种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV 313 bp、 PRV 217 bp和PCV2 447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明两者的符合率为100％,表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这3种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用建立的多重PCR检测方法,检出PPV阳性42份,阳性率为19.91%;PRV阳性26份,阳性率为12.32%;PCV2阳性56份,阳性率为26.54%;2种以上病毒混合感染25份,混合感染阳性率为11.85%。检测结果表明,山西省猪群已感染这3种疫病。     

牛轮状病毒与病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR检测方法的建立

建立了能够同时检测牛轮状病毒（BRV）与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的双重RT-PCR方法。应用两对特异性引物进行了双重RT-PCR扩增,这两对引物分别对应于BRV的VP7基因和BVDV的5-UTR中的部分编码序列,其扩增产物分别为342bp和196bp。说明该方法的特异性强、敏感性高,可检测到1pg的病毒RNA,可应用于临床诊断和流行病学研究。     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Differential Detection of Classical,Highly Pathogenic and Vaccine Strains of North American Genotype PRRSV

To establish a rapid method for differential detection of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), a multiple RT-PCR assay was established. In this assay, two pairs of primers were designed according to the genomic sequences of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of PRRSV. The assay could only detect PRRSV, but not detect CSFV, FMDV, PRV and PCV2. The detection limit of the method was as little as 1.13×10³ copies/μL of templates. The established assay was successfully used to detect 349 clinical samples and 119 samples were positive for PRRSV, of which 5 samples were positive for classical PRRSV (C-PRRSV), 107 samples for highly pathogenic PRRSV (HP-PRRSV) and 7 samples for TJM-F92 vaccine strain (V-PRRSV), while 7 samples were positive for HP-PRRSV and V-PRRSV. The results indicated that the established multiple RT-PCR assay could be used for differential detection and epidemiological investigation of PRRSV.