猪圆环病毒2型IgM抗体间接ELISA的建立

猪圆环病毒2型(PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合症的重要原发性病原,其感染的早期检测有助于及时采取防控措施。以重组衣壳蛋白(Cap蛋白)作为包被抗原,通过对反应条件的优化,建立了PCV2 IgM抗体间接ELISA,其最适抗原包被浓度为1.25 μg／mL,最适血清稀释度为1∶100,临界值为0.35。该检测方法与其他5种常见猪疫病阳性血清无交叉反应,特异性良好。批内、批间重复试验的变异系数均在2%~6%,重复性好。对100份临床样本的检测结果表明,该检测方法与国外同类试剂盒相比,敏感性为90.3%,特异性为92.8%,总符合率为92%。试验结果表明,所建立的PCV2 IgM间接ELISA特异性好和敏感性高,适用于PCV2感染早期的流行病学调查。     

猪圆环病毒2型CaP蛋白的表达及在ELISA中的初步应用

本研究旨在建立以PCV2 Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0 mmol·L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫反应活性,以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法.结果表明抗原最适包被浓度为2.16μg·mL-1;血清最佳稀释度为1:40;抗原最佳包被条件为4℃过夜;最佳封闭条件为1%BSA 37℃1 h;血清反应时间为37℃30 min;酶标二抗最适作用时间为37℃45 min;底物最佳反应条件为37℃显色15 min.用该方法对四川省184份猪血清样品进行检测,总阳性率为80.98%(149/184),与商品化的PCV2 ELISA试剂盒得到的结果基本一致.本试验成功建立了PCv2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测.     

猪圆环病毒2型Cap蛋白表达及免疫原性鉴定

以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。     

猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

以大肠杆菌原核表达系统表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白为抗原,建立猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法,优化ELISA反应条件,研制猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒。与商品化试剂盒相比,该检测试剂盒敏感性、特异性和符合率分别为95.12%、92.86%和94.55%;同时与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等多种病毒阳性血清无交叉反应。试剂盒具有较好的重复性,在-20 ℃至少可保存1年以上,将其应用于临床血清样品的检测,结果安徽、广东、广西采样猪场的PCV2阳性率分别为100%、48.39%、100%。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。     

猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

为了进一步提高对猪圆环病毒2型(PCV2)检测的特异性,利用PCV2Cap蛋白及酶标记Cap单克隆抗体,建立了一种检测猪血清中PCV2Cap蛋白抗体的阻断ELISA方法,并将其组装成试剂盒。对阻断ELISA试剂盒进行了敏感性、特异性、重复性、符合率和保存期测定。结果显示,其敏感性高,特异性强,批内批间重复性好,与商品化试剂盒符合率高,保存期长且性质相对稳定。先后制备了5个批次的阻断ELISA试剂盒,用于检测PCV2不同疫苗免疫猪血清、规模猪场PMWS发病猪及同群健康猪血清、不同日龄猪群血清.结果显示,PCV2油佐剂免疫组血清抗体水平相对较高,PWMS发病猪血清抗体水平高于同群健康猪,猪群中育肥猪血清抗体水平最高。     

应用原核表达的猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白建立一种间接ELISA诊断方法

本试验在最佳诱导条件下获得猪圆环痛毒Ⅱ型重组Cap蛋白的基础上，利用HisBind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化，通过Westernblot检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化后的重组融合蛋白作为诊断抗原，对ELISA反应条件进行优化，初步建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。用该法对广东、广西一些地区收集到的380份血清样品进行检测，检测结果阳性率为86．1％，从中随机取90份猪血清样品与国产商品化试剂盒检测结果对比，符合率为95．6％，表明本实验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性，适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。     

免疫小鼠血清中猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒的研究

为研制一种小鼠血清中猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）抗体检测试剂盒,以PCV2 Cap蛋白兔多抗作为包被用抗体,捕获纯化的PCV2 Cap蛋白,制备抗原检测板,辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG作为二抗,建立检测小鼠血清中PCV2抗体ELISA检测方法并制备试剂盒。采用所制备的ELISA试剂盒对50份已知阴性血清样本进行检测,临界OD450nm值为0335;采用ELISA试剂盒与IFA分别对100份血清检测,总符合率为96%,检测小鼠血清敏感性效价达1∶16000,与其他常见的猪病毒小鼠阳性血清无交叉反应,2～8 ℃保存15个月稳定,批内变异系数为2.28%～4.17%,批间变异系数为4.27%～6.02%,具有良好的敏感性、特异性、稳定性及重复性;采用ELISA试剂盒对不同来源疫苗免疫组小鼠血清进行检测,均显示良好效果。研究表明,本研究制备的ELISA试剂盒可用于小鼠血清中PCV2抗体效价检测。     

猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

利用纯化的重组杆状病毒表达猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白作为检测抗原,建立一种间接ELISA方法用于血清抗体检测。昆虫细胞株（Sf-21）接种重组杆状病毒,对蛋白表达参数及纯化工艺进行了优化,制备了5批重组蛋白抗原,表达量占总蛋白的18.7%左右;Ni2＋亲和层析柱纯化获得重组蛋白纯度为90.1%;重组蛋白可被特异性抗体识别,具有良好的免疫活性。用建立的ELISA法对30份已知阴性血清样本检测临界OD405nm值为0.343;ELISA与IPMA对150份血清进行平行检测符合率为95.3%,特异性为91.2%,敏感性为96.5%;与其他几种常见猪病毒参考血清无交叉反应。组装的试剂盒批内和批间变异系数分别为4.0%～4.8%和8.9%～9.9%;置-20℃保存12个月稳定。试剂盒对人工感染猪血清检测结果,接种后第5周抗体阳转,第8周～9周抗体水平达到高峰;对来自黑龙江、吉林、河北、上海等地猪场1085份血清抗体检测,阳性率为73.6%。研制的ELISA试剂盒为临床PCV2血清抗体检测及疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。     

猪圆环病毒2型Rep蛋白ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的方法,本研究通过基因合成PCV2的Rep编码序列,将其克隆至pET-28a(+)并在E.coli中表达,表达的重组Rep蛋白经Ni2+亲和纯化.采用纯化的目的蛋白作为包被抗原,建立检测PCV2 Rep蛋白抗体的间接ELISA方法.结果表明最佳抗原包被浓度为200 ng/孔,血清和二抗最佳反应时间分别为1h和30 min.该方法具有良好的特异性和敏感性,与韩国金诺公司试剂盒的符合率为81.4％,表明建立的ELISA方法可以用于PCV2的流行病学检测.     

猪圆环病毒2b型Cap蛋白多克隆抗体制备及其生物学特性分析

为了使猪圆环病毒2b型(PCV2b)Cap蛋白在猪圆环病毒病等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,本试验将编码PCV2b Cap蛋白的ORF2基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,并构建pET-32a-ORF2重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21受体菌后,通过IPTG诱导表达重组蛋白,将重组蛋白用镍柱进行纯化并免疫大白兔,制备兔抗PCV2b Cap蛋白的多克隆抗体。利用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光及病毒交叉反应等试验对制备的多克隆抗体进行生物学特性检测。ELISA检测结果显示,该抗体效价可达到1:2¹⁶;Western blotting检测结果显示,该多克隆抗体可与PCV2b产生特异性的反应条带,说明其具有较好的反应活性;间接免疫荧光试验结果显示,该多克隆抗体能识别感染PK-15细胞中的PCV2b,说明该多克隆抗体具有鉴别诊断PCV2b的能力;病毒交叉试验结果显示,该多克隆抗体能与PCV2b反应,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PRoV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等猪源病毒发生交叉反应,表明该多克隆抗体具有高度特异性。本试验制备的抗PCV2b Cap蛋白多克隆抗体为PCV2b病原特性研究及该病的临床检测奠定基础。     

Preparation of Polyclonal Antibody against Porcine Circovirus Type 2b Cap Protein and Analysis of its Biological Characteristics

In order to build more effective use of porcine circovirus type 2b (PCV2b) Cap protein on the diagnosis and control of diseases like porcine circovirus disease, the ORF2 gene which encoding porcine circovirus type 2b Cap protein was cloned into the prokaryotic expression vector pET-32a (+), constructing a recombinant plasmid pET-32a-ORF2, then the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 and induced by IPTG to express recombinant protein, the recombinant protein was purified with nickel column.Then polyclonal antibody (PcAb) was prepared by immunization of rabbit with purified protein.ELISA, Western blotting, indirect immunofluorescence assay and the specificity experiments were used to detect the biological characteristics of the polyclonal antibody.The titer of polyclonal antibody was about 1:2¹⁶ detected by ELISA.Western blotting result confirmed that polyclonal antibody could react with PCV2b specially.Indirect immunofluorescence assay showed that polyclonal antibody was able to detect PCV2b in PK-15 cells, this result suggested that the polyclonal antibody had the ability to differential diagnosis of PCV2b.The specificity experiment showed that the polyclonal antibody only reacted with PCV2b, and did not react with PEDV, TGEV, PRRSV, PRoV, PRV and PPV.The polyclonal antibody against PCV2b prepared in this study provided a powerful tool for the study of etiological characteristics and clinic diagnosis of this disease.     

猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株E2蛋白的表达及抗体制备

表达去除SD0803E2基因跨膜疏水区的sE2蛋白并制备其抗体,为猪源BVDV诊断奠定基础。RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2,转化BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光等方法鉴定获得的抗体。结果显示,抗体效价最高可达1∶256 000;制备的抗体可与rsE2蛋白特异性结合;该抗体可特异性识别BVDV感染MDBK细胞表达的E2蛋白,显示抗体高度的特异性。成功构建pGEX-4T-1-sE2原核表达质粒,诱导其表达的蛋白免疫家兔,成功制备的猪源BVDV SD0803株E2抗体。     

猪圆环病毒2型特异性IgA间接ELISA检测方法的建立与初步应用

为检测猪圆环病毒2型(PCV2)特异性IgA抗体,本研究以纯化的PCV2 Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgA为二抗,建立检测PCV2特异性IgA抗体的间接ELISA方法.确定最佳抗原包被浓度为200 ng/孔,HRP标记羊抗猪IgA的最佳稀释度为1∶30 000.所建立方法与抗猪瘟病毒等病原的抗体间无交叉反应.结果表明该方法具有较好的特异性,组内和组间重复性试验的变异系数介于0.12％～5.47％,具有较好的可重复性.该方法为进一步研究猪感染PCV2和PCV2疫苗免疫后特异性黏膜IgA水平及进行黏膜免疫评价提供了有效的检测方法.     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型（PCV3）重组核衣壳（Cap）蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16 ℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

检测鸭呼肠孤病毒抗体间接ELISA方法的建立

RT—PCR扩增鸭呼肠孤病毒（Duckreovirus,DRV）的dB基因,克隆到pET-32a（＋）表达载体,再转化大肠杆菌Transetta（DE3）;含有重组质粒pET—σB的大肠杆菌经IPTG诱导,获得大小为55000的以包涵体形式表达的σB重组蛋白。Westernblotting显示,σB重组蛋白能够与兔抗DRV多抗血清特异性结合。以高亲和NI—NTA树脂在变性条件下纯化、梯度尿素复性的σB重组蛋白为包被抗原,建立了检测DRV抗体的间接ELSIA方法。分别以间接ELSIA方法和血清中和试验对DRV感染鸭血清和SPF鸭血清进行检测,两者的符合率为100％。该间接ELSIA方法对鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒和禽流感病毒阳性血清均无交叉反应。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白的截短表达与活性检测

本研究参照已发表的PCV2基因组序列,设计合成1对特异性引物,以PCV2基因组DNA为模板,PCR扩增了长约480 bp的ORF2基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用亲和层析法在变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.396 mg/mL。纯化蛋白经免疫印迹、间接ELISA检测证明具有良好的抗原性和特异性。