1株野鸭源H6N2亚型AIV对SPF鸭的致病性

本研究选取2周龄SPF鸭(绍兴麻鸭)自天然孔感染1株野鸭源H6N2亚型LPAIV,评价其对幼龄鸭的致病性。结果显示,试验感染鸭临床症状较轻微,病毒在鸭消化道复制能力较呼吸道内更强,且具有水平传播的能力。仅能在盲肠扁桃体和法氏囊2个组织器官中检测到病毒,但可对法氏囊等多个组织器官造成不同程度的损伤。此外感染鸭可产生HI抗体,并在第21天达到高峰。结果表明,该株H6N2亚型LPAIV对幼龄鸭的致病力较低,在AIV病毒传播中幼龄鸭起到了一定作用,为研究H6N2亚型LPAIV的致病机制及AIV发病机理提供了理论数据。     

H9N2亚型AIV河北分离株Z1对小鼠致病性的研究

为了研究H9N2亚型禽流感病毒河北分离株Z1对哺乳动物小鼠的致病性,试验采用H9N2亚型AIV Z1株感染Balb/c小鼠后,观察小鼠的临床表现和组织病理学变化,通过测量体重、体温、采食量,检测禽流感病毒靶器官肺脏内病毒含量的动态变化及相应血清抗体水平的情况。结果表明:小鼠感染后表现为采食量和体温有一定程度的下降、体重减少等明显的临床发病症状,组织病理学变化特征为肺部严重的淤血、水肿和炎性细胞渗出。14 d后感染小鼠能产生相应的病毒抗体。H9N2亚型AIV Z1株无需适应就能感染哺乳动物小鼠,说明Balb/c小鼠可作为研究人-禽流感病毒的动物模型。     

一株低致病性H5N6亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性分析

2019年11月本实验室从家禽监测样品中分离鉴定到一株低致病性H5N6亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/chicken/Hebei/S1/2019(H5N6)(简称CK/HeB/S1/19).为进一步了解其生物学特点,本实验对其全基因组测序并进行遗传演化分析,结果显示,该病毒属于2.3.4.4h分支,碱性裂解位点为P...     

一株H5N6亚型禽流感病毒对鸭和小鼠的致病性研究

为了研究一株从鹭中分离到的禽流感病毒(AIV)A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)对鸭和小鼠的致病力,本研究通过对鸭和小鼠滴鼻点眼和鸡的颈静脉注射进行攻毒试验,观察其致病力和组织病理学等变化,对其生物学特性进行初步研究。结果显示,该毒株的鸡胚半数感染量(EID₅₀)为10^-8.16/0.1 mL,静脉接种致病指数(IVPI)为2.76。对鸭的半数致死量(LD₅₀)为10^-4.0/0.2 mL,对小鼠的LD₅₀为10^-4.67/0.05 mL。以10⁶ EID₅₀/只滴鼻点眼感染鸭,主要表现为食欲下降、精神萎靡、肿头流泪等症状,大多数鸭在感染后4~7 d死亡,感染后第7 天肝脏、肺脏、肾脏仍在排毒,解剖可见心包积液、肺脏淤血、肾脏肿大等症状,病理切片可见心脏、肝脏、脾脏、肾脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。以5×10⁵ EID₅₀/只滴鼻感染小鼠,主要表现为食欲下降、精神萎靡、被毛粗乱、聚堆等症状,大部分小鼠在感染后5~7 d死亡,第7天时只有肺脏仍在排毒,各脏器解剖学病变不明显,病理切片可见心脏、肾脏、肺脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。研究结果表明,该H5N6亚型AIV毒株对鸭和小鼠具有很强的致病力,IVPI大于1.2,为高致病性AIV,本研究为H5N6亚型AIV研究和防控提供了理论基础。     

2株H9N2亚型AIV分离株的遗传演化及其对小鼠的致病性研究

为了解江苏地区H9N2亚型禽流感病毒(AIV)流行株的生物学特性,从江苏某养殖场分离到2株H9N2亚型AIV,A/chicken/Jiangsu/25/2019 (CK/JS/25/19)和A/chicken/Jiangsu/43/2019 (CK/JS/43/19),进行病毒纯化、全基因组测序、遗传进化分析,并研究其...     

一株野鸟源H9N2亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及致病性研究

为进一步了解2014年分离自我国南方野鸟粪便中的一株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)Wide Bird/Hu N/SC1400/2014(H9N2)(WB/400/14)的生物学特性,本研究对其进行全基因组序列测定、进化分析及SPF鸡、SPF鸭和BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析显示:该分离株的HA裂解位点基序为333PAASDR↓GL340,其中不存在多个连续的碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒(LPAIV)氨基酸序列特征。该分离株不同基因片段来源较复杂,分别与H9、H6、H4、H1、H11、H10、H3等多种亚型的LPAIV同源性较高,呈现明显的多样性。感染性试验显示,WB/400/14不能够在SPF鸡和小鼠体内有效复制,但病毒感染SPF鸭后能够在部分脏器中检测到病毒的存在,并且感染鸭能通够过咽喉和泄殖腔同时向外排毒,而同居感染鸭仅通过泄殖腔向外排毒,表明分离株在SPF鸭群中具有良好的水平传播能力。本研究为AIV的监测和防控提供实验依据。     

2株鸭源H10N6亚型禽流感病毒的遗传进化分析及其致病性研究

为了掌握H10N6亚型禽流感病毒在我国的遗传进化特征和生物学特性,本研究通过基因组测序和遗传演化分析,对2020年在福建某活禽市场上分离得到的F1464和F1473两株鸭源H10N6亚型禽流感病毒基因组进行分析,并进一步研究了其对SPF鸡及小鼠的致病性。结果：序列分析显示,HA基因与人感染的H10N8和H10N3亚型禽流感病毒同源性分别为91.4%～91.5%和95.3%～95.4%;遗传进化分析显示,2株病毒属于欧亚谱系分支,可能是由包括H1、H2、H3、H4、H9、H10和H11在内的多种AIV亚型重组而来;SPF鸡感染试验显示,F1464和F1473毒株均为低致病性病毒;小鼠感染试验显示,F1464毒株可以在小鼠鼻甲、肺、脾脏中高效复制,并导致小鼠体重下降,而F1473毒株仅在鼻甲和肺中复制,对小鼠的致病力更低。本研究为H10亚型禽流感的防控和公共卫生风险评估提供了数据支持。     

2007年～2010年H9N2亚型禽流感病毒分离株对SPF鸡的致病特性研究

本研究对2007年～2010年我国H9N2亚型禽流感病毒分离株的鸡胚平均死亡时间(MDT)进行分析,发现自2008年下半年来分离的H9N2亚型禽流感病毒对鸡胚的致病性有增强的趋势,在此基础上,选择MDT在60.5～96.3 h之间的9株病毒,比较其对SPF鸡的致病力.结果表明,对鸡胚致病性强的毒株,对SPF鸡的致病性也较强,能引起气管、肺、十二指肠、肾和脑等多器官的系统性感染,而且病毒在各组织器官的复制能力与致病性呈正相关.在感染SPF鸡后,所有毒株均呈现不同程度的排毒,而致病力较强毒株的感染组,排毒的比例更高,排毒时间也更长.这些数据表明,H9N2病毒在进化过程中,致病力发生了一定的变化,新近出现了一些对鸡致病力增强的毒株,这提示我们必须重视对H9N2病毒进化和变异的监测,加强对H9N2病毒的防控.     

H5N1亚型禽流感病毒对鸭的致病性研究

为评估H5N1亚型禽流感病毒(AIV)在实验室环境下对鸭的致病力,本研究以无特殊病原(SPF)鸭为模型,对我国近年分离的7株病毒进行了致病力分析。结果发现其中4株病毒对鸭致死率为100%,2株病毒对鸭的致死率分别为60%和80%,另外1株病毒,A/goose/Hubei/51/05(GS/HB/51/05),对鸭无致病力。本研究还发现,与高致病力毒株一样,GS/HB/51/05也可在鸭体内呈全身性复制,并且可通过喉头和泻殖腔向外排泄。我们推测GS/HB/51/05可能是中国南方出现的其他对鸭呈高致病力的H5N1病毒的祖先,对这些病毒的系统研究,可揭示H5N1亚型AIV对鸭的致病力遗传机制。     

两株野鸟源H6N1和H6N8亚型禽流感病毒的遗传进化分析和对小鼠的感染性研究

为了解2016年在江西省鄱阳湖野鸟中分离的两株H6N8和H6N1亚型禽流感病毒(P419和P339)的生物学特性,本研究对其进行了全基因组序列测定、受体分析和对BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析结果显示,这2个毒株属于不同的分支,并经历了不同亚型病毒间的广泛重组。2个分离株的HA裂解位点基序均为PQIETR/GLF,符合低致病性禽流感病毒的分子特征。HA蛋白受体结合位点处第138、226、228位氨基酸残基分别为丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G),具有结合禽样流感病毒受体的分子特征。受体结合试验表明,分离毒株仅能结合禽样受体。Balb/c小鼠的感染性试验结果显示,分离株只在小鼠的上呼吸道鼻甲中进行有限复制,使小鼠体重发生轻微变化,未表现明显临床症状,表明这2株分离株可感染小鼠,但致病力不强。     

野鸟源H5N8禽流感病毒遗传变异分析与致病性评估

本试验在野鸟禽流感病毒紧急疫情检测过程中鉴定并分离到1株H5N8高致病性禽流感病毒,利用病毒全基因组测序、系统发育及关键氨基酸位点分析解析了该野鸟源H5N8禽流感病毒分离株遗传进化情况,通过体外复制动力学试验及小鼠感染试验,评价了该野鸟源H5N8禽流感病毒分离株对哺乳动物致病性。进化分析显示,该病毒株属于Clade 2.3.4.4,可以不经适应直接感染小鼠并在呼吸系统内复制,表现出有限的组织嗜性,对小鼠呈低致病性。其在体内外复制能力较低。结果表明,本试验加深了对野生鸟携带H5N8禽流感病毒的认识和理解、对野鸟源H5N8禽流感病毒生物学特性的评价,为预测野鸟源H5N8禽流感病毒遗传进化趋势及其生物安全风险评估提供借鉴和参考。     

不同H9N2亚型禽流感病毒株致病力的比较试验

参照NDV评价毒力的方法对1998—2008年间收集的25株H9N2AIV的致病性进行了比较研究。结果显示,25株H9N2AIV不同毒株间致病性有较大差异,大致分为3类：致病性偏强、致病性中等和致病性较弱。从中选出致病力有差异的8个毒株进行了1日龄雏鸡脑内接种指数（ICPI）、6周龄鸡静脉接种指数（IVPI）以及8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,结果证明大部分毒株ICPI和IVPI基本上为0,排毒散毒的高峰期在攻毒后第5天到第6天。在25个毒株中,3#和12#表现出了比较高的致病性,不仅其EID50值最高（分别为10-8.8/0.2mL和10-8.8/0.2mL）、ELD50值最高（分别为10-7.9/0.2mL和10-8.7/0.2mL）,而且鸡胚平均死亡时间也最短（分别为66.5,69h）。3#、12#还出现了1日龄雏鸡脑内接种指数（分别为0.238,0.437）和6周鸡静脉内接种指数（分别为0.34,0.51）。在8周龄SPF鸡人工感染排毒试验中3#和12#毒株的排毒量大,排毒时间也明显长于其他毒株（第2～9天）。以上试验结果表明我国H9N2AIV不同毒株致病性有明显差异,呈多态性,致病性偏强的毒株造成鸡群较高的死亡率。     

H9N2亚型禽流感病毒冷适应株的培育及SPF鸡胚感染后的免疫应答分析

H9N2亚型禽流感病毒(H9N2AIV)冷适应疫苗可以弥补灭活疫苗临床保护效果的不足。为明确宿主对冷适应疫苗的免疫应答效应,本研究将H9N2AIV(A/chicken/Shandong/903/2013,CK/903/2013)接种10日龄SPF鸡胚连续降温传代,获得在25℃能够稳定复制的冷适应株Ca30。实验结果显示:Ca30株具备冷适应性和温度敏感性,在传代过程中病毒HA蛋白出现多个位点的氨基酸突变,在25℃传代20次后已经获得稳定的氨基酸突变。动物感染试验结果显示,以106.0EID50的剂量鼻腔感染1周龄SPF鸡,Ca30株仅在喉气管中低水平复制,病毒接种后第3周SPF鸡血清针对Ca30株、异源病毒株1167的血凝抑制效价均达到最高,分别为8.2log2和5.8log2,接种后第4周针对母本病毒CK/903/2013的血凝抑制效价达到最高值7.6log2。qPCR检测结果显示,Ca30在25℃时能够在鸡胚肺脏、肝脏和心脏中复制,对肺脏的亲和力最强。利用qPCR检测冷适应株Ca30接种鸡胚后各脏器细胞因子的转录水平,结果显示,Ca30株感染鸡胚后,引起鸡胚肺脏中IL-1β、IL-6、IL-12、IL-8、OAS和MDA5转录水平上调,上调4.18~16.47倍;感染后8h引起鸡胚心脏中IL-1β、IL-6、IL-12、IL-8、OAS和MDA5的转录水平上调,之后降低甚至下调;72h时引起鸡胚肝脏中IL-1β、IL-6、IL-8和OAS转录水平上调,上调4.28~6.53倍;在鸡胚脑组织中,各类细胞因子的转录水平变化无明显的规律。本研究培育了一株H9N2AIV冷适应毒株Ca30,为深入研究冷适应弱毒疫苗的免疫保护机制提供了素材。     

一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及对小鼠的感染性研究

为了解H6N6亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对2015年在广东活禽交易市场分离的一株鸭源AIV DK/GD/S1182/2015(H6N6)进行了全基因组测序、遗传演化分析和对BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析显示,该病毒的HA蛋白裂解位点处仅有一个碱性氨基酸,符合低致病性AIV的分子特征;HA蛋白的222V和228S,可以增强病毒对α-2,6唾液酸受体的结合能力。NA蛋白颈部有11个氨基酸的缺失,这将会影响NA的神经氨酸酶活性;该病毒可能是2010年广东H6N6猪流感病毒与2014年广西AIV重组产生。小鼠感染性试验表明,该分离株不需要预先适应就能够在小鼠的肺脏内高效复制,提示该分离株具有感染哺乳动物的潜在风险。本研究对H6亚型AIV监测和相关生物学特性研究具有一定的指导作用。     

两株鸭源H6N2亚型禽流感病毒的序列分析及对鸡的致病性研究

为了解鸭源H6N2亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对两株鸭源H6N2亚型AIV [A/duck/Hube/Sd061/2008(HB/061/08)和A/duck/Fujian/S2080/2009(FJ/080/09)]进行序列分析和致病性试验.序列分析显示:两株病毒的HA和NA基因均来源于我国近年流行的H6亚型病毒株,但是HB/061/08株的内部基因可能来源于H9、H5等其他亚型.与病毒株HB/061/08 NP、PA、PB2基因的核苷酸同源性最高的病毒株为A/environment/Hunan/2-84/2007(H9N2);与M、PB1和NS基因的核苷酸同源性最高的病毒株分别为A/duck/Zhejiang/11/2000(H5N1)、A/chicken/Hebei/7/2008(H9N2)和A/chicken/Henan/L1/2008(H9N2).两株病毒的抗原差异性较显著,相关系数为0.49;用106 EID50病毒剂量感染4周龄SPF鸡,结果显示FJ/080/09株不能感染鸡,而HB/061/08株在鸡体内能够高效复制,并通过咽喉和泄殖腔持续排毒.鸡群感染后第3d采取脏器样品,在气管和肺部能够检测到病毒存在,部分脏器和器官的组织学观察显示存在一定程度的病理变化.以上数据表明,H6亚型AIV在跨越不同宿主感染的传播过程中,对新宿主适应能力的差异导致对其致病性的差异.     

免疫鸡群中分离的H9N2亚型禽流感病毒的分子特征研究

为研究浙江省禽流感病毒(AIV)的流行病学情况,本实验应用鸡胚传代方法从AIV疫苗免疫鸡群中表现典型呼吸症状的产蛋鸡体内分离1株H9N2亚型AIV A/Chicken/Jiande/01/2009(H9N2)。氨基酸序列分析显示,HA受体结合位点出现了人流感病毒结合位点226L,M基因出现S31N的突变。遗传进化分析显示,A/Chicken/Jiande/01/2009的M基因和PB2基因属于G1-Like谱系,HA基因、NA基因和NS基因属于Ck/BJ/1/94-Like分支,而NP基因、PA基因和PB1基因属于Ck/SH/F/98-Like谱系。这些资料表明,A/Chicken/Jiande/01/2009(H9N2)为一株重排病毒。     

一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从福州市某活禽市场采集的鸡泄殖腔棉拭子样品中分离出1株病毒,经血凝抑制试验(HI)和聚合酶链反应(PCR)方法鉴定为H9N2亚型禽流感病毒。在GenBank基因库中对该病毒株的3个基因片段的测序结果进行BLAST比对分析表明,3个基因片段均属于H9N2亚型禽流感病毒的基因。HA基因遗传进化分析表明,该病毒分离株与代表株DK/HK/Y280/97处于同一分支,与上海的鸡源分离株A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)同源性最高,同源性为99.5%。     

B亚型禽偏肺病毒对SPF鸡的致病性

利用分离的1株B亚型禽偏肺病毒,采用静脉注射和点眼滴鼻两种途径接种SPF鸡,并在接种同时免疫新城疫弱毒疫苗。在攻毒后3、6、9、12、15d,每组随机抽取3只翅下采血,检测血液生化指标,利用血凝和血凝抑制试验检测新城疫HI抗体效价;利用流式细胞术分析外周血CD40／CD8比值,ELISA试剂盒测定血清中IL-2、IFN7的含量;同时观察静脉注射组和点眼滴鼻组鸡的临床症状、剖检病变和病理组织学变化。结果表明,攻毒后9～15d,静脉注射组和点眼滴鼻组外周血CD4＋/CD8＋比值和血清II-2、IFN-γ的含量均显著低于对照组（P〈0．05）,而静脉注射组与点眼滴鼻组间无显著差异（P〉0．05）;静脉注射组和点眼滴鼻组的免疫器官指数低于对照组,但各组间差异不显著（P〉0．05）;各组间新城疫HI抗体水平无显著差异（P〉0．05）;血液生化指标仪谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）在攻毒后显著升高（P〈0．05）,其他指标在各组间无显著差异（P〉0．05）;静脉注射组和点眼滴鼻组在感染后3～10d出现轻微临床症状;病理组织学检测结果显示,静脉注射组和点眼滴鼻组的呼吸道和肝脏病变最明显。综上所述,B亚型禽偏肺病毒感染SPF鸡后,在一段时间内抑制机体细胞免疫,导致免疫机能下降,并引起轻微的组织病变;B亚型禽偏肺病毒通过两种不同的攻毒途径对SPF鸡的致病性无显著差异。