北京鸭／番鸭杂交体系肝脏组织基因表达差异的研究

以番鸭、北京鸭及其杂交后代半番鸭为研究对象,利用mRNA差异显示技术得到肝脏组织基因表达差异图谱.mRNA差异显示表明,肝脏组织的基因表达在纯种群和杂种群之间存在着显著的质和量的差异;5对引物组合显示出41条差异带;分属于7类10种基因表达模式,其中量的差异有3类4种,质的差异有4类6种.这些基因差异表达模式说明了杂种的基因表达调控方式发生了变化,可能是mRNA水平上杂种优势形成的分子遗传基础.     

白来航蛋鸡与丝羽乌骨鸡及其杂交后代卵巢组织的基因表达差异研究

白来航蛋鸡与丝羽乌骨鸡杂交 ,正反交组合鸡群 32周龄产蛋数的杂种优势率分别为 12 .2 %和 2 1.6 1%。mRNA差异显示研究表明 :产蛋高峰期 (32周龄 )卵巢组织的基因表达在杂种群与亲本纯种群之间存在显著的质和量的差异 ;8对引物组合显示出 91条 (31.2 7% )差异带 ;分属于 7类 2 2种基因差异表达模式 ,其中量的差异有 3类 8种。这些基因差异表达模式的存在说明了杂种的基因表达调控方式发生了变化 ,这必然与正反交组合鸡群具有较高的杂种优势率有关 ,或是mRNA水平上杂种优势形成的分子遗传基础。     

家鸭×番鸭杂种下调表达新基因r-MHD2的克隆

以北京鸭、法国番鸭及其正反交F1代杂种为试验材料,采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)方法分析不同试验组肌肉组织基因表达差异,结合抑制性消减杂交(SSH)加以验证,发现一个杂种下调表达基因r-MHD2,对鸭r-MHD2基因698 bp片段BLASTING结果表明,该基因与鸡(Gallus gallus)、非洲爪蟾Xenopus laevis和Xenopus tropicalis同源性分别为91%、78%和77%。r-MHD2基因的具体分子功能尚属未知。     

家鸭×番鸭杂种下调表达新基因r-MHD2的克隆

以北京鸭、法国番鸭及其正反交F1代杂种为试验材料,采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)方法分析不同试验组肌肉组织基因表达差异,结合抑制性消减杂交(SSH)加以验证,发现一个杂种下调表达基因r-MHD2,对鸭r-MHD2基因698 bp片段BLASTING结果表明,该基因与鸡(Gallus gallus)、非洲爪蟾Xenopus laevis和Xenopus tropicalis同源性分别为91%、78%和77%.r-MHD2基因的具体分子功能尚属未知.     

番鸭脂肪酸合成酶基因的克隆及填饲对其mRNA水平的影响简

本研究以番鸭肝脏为试验材料,通过RT-PCR扩增出番鸭脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）部分CDS序列,利用相关分子生物学软件对其进行分析,同时采用实时荧光定量PCR技术检测FAS基因在成年番鸭各组织中的表达特性及填饲对番鸭肝脏和腹脂中该基因表达的影响。结果表明,克隆出的番鸭FAS基因CDS片段大小为1122 bp,编码374个氨基酸,与近缘物种禽类核苷酸同源性为92%～99%;实时荧光定量PCR结果表明,番鸭FAS基因在肝脏和腹脂中高表达,说明FAS具有组织表达特异性;填饲导致肝脏中FAS基因表达显著升高（P＜0.05）。本试验结果可为进一步研究FAS基因在番鸭肝脏脂质代谢中的作用奠定基础。     

北京鸭×番鸭杂种优势差异表达基因GHR的克隆

以北京鸭、法国番鸭及其正反杂交1代为试验材料,采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)方法分析不同试验组肌肉组织基因表达差异,结合抑制性消减杂交(SSH)加以验证,发现生长激素受体(GHR)基因在杂种中上调表达。鸭GHR基因3′端578bp片段测序及比对结果表明,该基因与鸡GHR基因核苷酸序列同源性为90%,氨基酸序列同源性为93%。     

日粮营养水平对番鸭GH、GHR基因表达影响的研究

为了解番鸭在生长发育过程中不同日粮营养水平对番鸭生长激素(GH)、生长激素受体(GHR)基因在肌肉组织中的表达情况,试验在0~21、22~42和43~91日龄分别设计9个营养水平的日粮,分别饲喂番鸭,在21、42和91日龄分别对番鸭进行屠宰获得其胸肌和腿肌的组织样,采用实时荧光定量PCR检测不同样品之间GH、GHR基因mRNA表达的差异。结果表明,在21、42日龄时,GH、GHR基因在同组织中不同日粮营养水平之间均无显著性差异(P0.05)。在91日龄时,各组胸肌中GH基因表达无显著性差异(P0.05),各组腿肌中GH基因表达差异显著(P0.05),各组胸肌、腿肌中GHR基因表达均有显著性差异(P0.05)。在番鸭早期生长发育过程中,GH、GHR基因表达未因日粮营养水平的不同而出现差异,但是在91日龄时会受到日粮营养水平的影响。     

摘除卵巢对布尔山羊杂种母羊组织IGF-I和IGF-1R基因表达的影响

为了研究卵巢摘除对布尔山羊杂种母羊类胰岛素样生长因子1(ginsulin-like growth factor 1,IGF-1)和类胰岛素样生长因子1受体(ginsulin-like growth factor 1receptor,IGF-1R)基因表达的影响。本试验将体质量相近的5月龄布尔山羊杂种母羊作为研究对象,随机分为处理组和对照组,每组20只。试验开始时摘除处理组母羊的卵巢,对照组不摘除。饲养50d后,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)相对定量方法检测肝脏、背最长肌、股二头肌和肾周脂肪中IGF-1和IGF-1R基因mRNA的相对表达量。卵巢摘除后母羊背最长肌和肝脏组织中IGF-1基因mRNA的相对表达量分别是对照组的6.19倍和6.01倍(P<0.01);IGF-1R基因表达量分别是对照组的11.86倍和9.96倍(P<0.01)。处理组母羊股二头肌中IGF-1基因mRNA的相对表达量与对照组差异不显著(P>0.05);IGF-1R基因是对照组的4.86倍,且差异显著(P<0.05)。在肾周脂肪组织中,处理组母羊IGF-1基因和IGF-1R基因mRNA的相对表达量较对照组增加,但差异均不显著(P>0.05)。由此可见,卵巢摘除可以上调背最长肌和肝脏中IGF-I和IGF-IR基因的表达以及股二头肌中IGF-IR基因的表达。     

SLC12A9、GNG2基因在正常与啄羽番鸭不同组织中的表达差异分析

为探究基因溶质载体家族12成员9(SLC12A9)、G蛋白Y2亚基(GNG2)在正常番鸭(不具有啄羽行为)表达量最高的组织及是否与番鸭啄羽行为相关,本研究共选取27只番鸭,分为9组,每组3个重复,其中选取正常番鸭3组,采集心、肝、脾、肺、肾、胰、肌胃、腺胃、大脑、小脑、视丘11个组织,进行实时荧光定量PCR分析其在各组织表达量差异性。结果显示:在mRNA表达量数值上,SLC12A9基因在番鸭心脏组织中的mRNA表达量最高,极显著高于其他组织,在肌胃中的mRNA表达量最低(P<0.01);GNG2基因在番鸭小脑组织中的mRNA表达量最高,其次是视丘,小脑与视丘组织均极显著高于其他组织,在肌胃中的mRNA表达量最低(P<0.01)。另外选取啄羽与正常番鸭各3组采集大脑组织,进行实时荧光定量PCR,分析基因SLC12A9、GNG2在正常番鸭与啄羽番鸭大脑组织的表达差异,结果表示:SLC12A9、GNG2基因在正常番鸭与啄羽番鸭的大脑组织均有表达,在mRNA表达量数值上,SLC12A9基因在正常番鸭的第3组mRNA表达量最高,极显著高于其他组,GNG2基因在啄羽第3组具有最高mRN...     

鸭卵巢组织基因差异表达与繁殖性状杂种优势率相关性分析

采用mRNA差异显示技术检测了产蛋高峰期高邮鸭、金定鸭及正反交组合群体卵巢组织中的基因差异表达,并分析了差异表达模式与繁殖性状杂种优势率的相关性.研究结果表明:杂交组合在开产日龄、42周龄产蛋数性状上表现出明显的杂种优势,杂种优势率>±10%;16对引物组合共扩增出326条cDNA片段,能够重现的有248条,重现率为76.03%,发现7种差异表达模式;相关性分析显示开产日龄、42周龄产蛋数杂种优势率与杂种超强表达模式呈极显著正相关(P<0.01),与杂种特异表达呈极显著负相关(P<0.01);共显性表达模式与开产日龄杂种优势率呈显著正相关(P<0.05);7种差异表达模式与42周龄种蛋受精率和受精蛋孵化率杂种优势率2个指标之间并不存在显著相关性(P>0.05).     

Cloning of Mx Gene of Beijing Duck and its Expression Analysis in DEF Incubated with Duck Reovirus

The study was aimed to research the structure and function of Mx gene in Beijing duck.Full-length sequence of Beijing duck Mx gene was amplified by RT-PCR from the total RNA extracted from duck embryo fibroblast(DEF) induced by Poly(I:C).Furthermore, the expression of Mx gene in DEF infected with DRV was described.Sequence analysis indicated that the duck Mx gene contained an open reading frame(ORF) of 2166 bp encoding a protein of 721 amino acids.A phylogenetic tree based on Mx gene sequence was constructed.The results showed that Beijing duck Mx gene had the lowest distance with the gene from wild duck available in GenBank.Homology analysis showed that Beijing duck Mx gene nucleotides and deduced amino acids shared 47.8% to 99.8% and 47.9% to 99.4% homologies with those from other animals available in GenBank, respectively.Fluctuation expression of Beijing duck Mx gene was found with DEF incubated with duck reovirus.Duck Mx gene was successfully cloned and predicted with characteristic of typical structure of Mx family.Gaining Beijing duck Mx gene laid a foundation for further researching Mx protein antiviral activity, molecular mechanism and interferon monitoring of poultry.     

北京鸭Mx基因克隆及其在鸭呼肠孤病毒感染的鸭胚成纤维细胞中的表达分析

本试验旨在研究北京鸭Mx基因的结构及功能。利用干扰素诱导剂Poly(I:C)诱导鸭胚成纤维细胞(DEF),提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增北京鸭Mx基因全长编码区序列,并观察其在感染了鸭呼肠孤病毒(DRV)的DEF中的动态表达情况。北京鸭Mx基因序列分析结果显示,该基因编码区全长2166 bp,编码721个氨基酸残基。通过与GenBank中已登录的脊椎动物Mx基因进行核苷酸系统进化树分析,结果显示北京鸭Mx基因与野鸭Mx基因关系最近。北京鸭Mx序列与其他动物基因序列的比对结果显示,核苷酸同源性为47.8%~99.8%,氨基酸同源性为47.9%~99.4%。DRV孵育DEF后,Mx呈波动性表达。结果表明,本试验成功克隆了北京鸭Mx基因,预测分析证实其编码的蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征,北京鸭Mx蛋白全基因的获得为下一步研究禽类Mx蛋白的抗病毒活性、作用机制及干扰素的监测奠定了基础。     

靶向cofilin2基因RNAi对鸭病毒性肠炎病毒增殖的影响

旨在探讨cofilin2基因的表达在鸭病毒性肠炎病毒(DEV)增殖过程中的影响.本研究通过已获得的鸭源cofilin2全基因序列(GenBank登录号:MF434775),设计出4对shRNA序列,插入载体中,并转染到鸭胚成纤维细胞中,经FQ-PCR方法和荧光显微镜观察筛选出具有较高干扰效率的shRNA序列,用干扰效率...     

鸭干扰素刺激基因的克隆、表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在克隆、表达鸭干扰素刺激基因（interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5,IFIT5）并制备其多克隆抗体。根据GenBank公布的绿头鸭IFIT5（登录号：KF956064）序列设计特异性引物,PCR扩增获得鸭IFIT5基因,并构建原核表达重组质粒pET-30a-IFIT5和pET-32a-IFIT5及真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5。原核表达获得鸭IFIT5重组蛋白后,进行SDS-PAGE分析,并利用镍柱亲和层析方法对重组蛋白进行纯化。以纯化的鸭IFIT5重组蛋白为免疫原制备兔抗鸭IFIT5多克隆抗体。利用间接ELISA测定多克隆抗体效价、用Western blotting鉴定其特异性;将真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5转化BHK21细胞,通过间接免疫荧光法鉴定多克隆抗体的反应性。结果表明：目的蛋白主要以包涵体的形式存在;制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体效价达1：49 600,可特异性识别鸭IFIT5重组蛋白,间接免疫荧光试验则表明纯化的多克隆抗体可特异性识别BHK21瞬时真核表达的鸭IFIT5蛋白。综上,成功克隆了鸭干扰素刺激基因IFIT5,制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体可用于鸭IFIT5蛋白的检测,可为鸭IFIT5蛋白的后续研究提供材料支撑。     

Molecular Cloning and Expression of Duck IFIT5 Gene and Preparation of Its Polyclonal Antibodies

The aim of this study was to clone the duck interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 5(IFIT5) gene,express duck IFIT5 protein and prepare the polyclonal antibodies against the duck IFIT5 protein.Primers specific for duck IFIT5 gene were designed according to Mallard duck reference sequence(accession No.:KF956064)available in GenBank.The complete ORF of duck IFIT5 gene was amplified by PCR.Recombinant prokaryotic expression plasmids pET-30a-IFIT5,pET-32a-IFIT5 and eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-IFIT5 were constructed.Recombinant duck IFIT5 proteins were expressed and analyzed by SDS-PAGE.Recombinant duck IFIT5 proteins were purified by Ni-NTA column affinity chromatography.Rabbit anti-duck IFIT5 polyclonal antibodies were prepared from rabbits which had immunized by recombinant protein pET-30a-IFIT5.The titer of polyclonal antibodies was detected by indirect ELISA,and the specificity was identified by Western blotting.Eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3.1-IFIT5 was transfected into BHK21 cells and the reactivity of polyclonal antibodies was verified by indirect immunoinfluscence assay.The results showed that recombinant duck IFIT5 proteins were expressed in the form of inclusion bodies.The titer of polyclonal antibodies was approximately up to 1:49 600.Rabbit anti-duck IFIT5 polyclonal antibodies could identify recombinant protein pET-32a-IFIT5.Indirect immunofluorescence assay (IFA) confirmed that the purified polyclonal antibodies could identify duck IFIT5 protein by eukaryotic expression system specifically.These results demonstrated that the duck interferon stimulating gene IFIT5 was cloned successfully,rabbit anti-duck IFIT5 polyclonal antibodies could be used in the detection of duck IFIT5 protein,and also provided material support for the further study of duck IFIT5 protein.     

Ⅰ型雏鸭肝炎病毒侵染后鸭组织中ALB基因表达的分析

检测Ⅰ型雏鸭肝炎病毒侵染后ALB基因mRNA以及ALB蛋白分别在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、小脑、腿肌和胸腺等组织中的相对表达量和含量并分析其意义。分别利用实时荧光定量RT-PCR技术和ELISA法检测ALB基因在易感组、抗病组和对照组各组织中mRNA的表达量以及ALB蛋白含量。总体而言,除腿肌外,ALB基因mRNA在易感组中的表达量极显著低于对照组和抗病组(P<0.01),抗病组显著或极显著低于对照组(P<0.01或P<0.05);各处理组间,肝、小脑和胸腺中ALB蛋白含量与ALB基因mRNA相对表达量规律一致,在其他组织中,各处理组间ALB蛋白含量差异均不显著(P>0.05)。RT-PCR与ELISA的结果比较可见,两者在肝脏、胸腺、小脑等与雏鸭肝炎病直接相关的指示性组织中表现一致。本试验研究结果,进一步揭示了ALB基因为Ⅰ型雏鸭肝炎病的抗性基因,与前期抑制性消减杂交法得到的结果一致,其表达量的变化可以作为区分易感鸭和抗病鸭的标志。