牦牛PrP c基因克隆与序列分析

朊病毒(prion)可引起人和动物的一系列神经退化性疾病，包括羊瘙痒病(serapie)、牛海绵状脑病(BSE)、人克雅氏病(CJD)等，这些疾病的共同特征是导致人和动物产生意识和运动功能的严重衰退直至死亡。正常朊蛋白(PrP^c)基因结构如何引起蛋白三维构象的变化及其构象病产生的机理尚不清楚，但朊蛋白病的潜伏期、个体敏感性、种间屏障等都与PrP^c基因结构的多态性相关。有学者报道了人、鼠、羊PrP^c基因多态性对朊病毒病的连锁关系。     

利用RNA干扰抑制牛胎儿成纤维细胞中朊蛋白基因prnp的表达

疯牛病是由朊蛋白基因prnp编码的正常朊蛋白PrPc发生构象变化为致病性朊蛋白PrPsc而引起的传染性疾病,PrPsc在中枢神经的聚集引发了动物的传染性海绵状脑病.降低(下调)PrPc的表达量使其减少向PrPsc转化,是抑制疯牛病的有效途径.本研究利用RNAi技术,针对牛源cDNA序列设计了3段PrPc干扰序列及一个阴性对照,将其连接到RNA干扰载体pGenesil-1上,转染牛胎儿成纤维细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测有干扰序列的有效性,并用700μg/mL G418对细胞进行药物筛选.结果表明,3对干扰片段的抑制效率分别是51.2%、85.7%和74.6%,阴性对照的干扰效率是2.05%,得到了一个较为有效地干扰片段,并且筛选出了稳定转染的细胞单克隆,为进一步的体细胞核移植提供供体细胞.     

用谷朊粉溶涨指数法测定谷朊粉品质

开发了一种新的谷朊粉品质检测方法。对小麦谷蛋白溶涨指数法的参数进行调整，在9种不同离心力条件下，测定从16个小麦品种中分离出的谷朊粉的溶涨指数，根据谷朊粉溶涨指数、面筋吸水率及面粉的蛋白质组分含量之间的关系，提出了用谷朊粉溶涨指数法测定谷朊粉品质的步骤及评价标准。结果认为：加入0.9 mL蒸馏水水化10 min，再加入0.9 mL 0.3%十二烷基磺酸钠(SDS)－乳酸溶液混合30 min，最后用5000×g离心力进行离心是谷朊粉品质测定的最佳技术参数，在此条件下的谷朊粉溶涨指数与面筋吸水率、小麦谷蛋白溶涨指数呈显著正相关(r＝0.541，0.547；P<0.05)，与面筋指数、不溶性谷蛋白含量呈极显著正相关(r＝0.608，0.589；P<0.01)，与单体蛋白含量呈显著负相关(r＝-0.573；P<0.05)。与测定谷朊粉品质的国家标准方法吸水率法相比，谷朊粉溶涨指数法能快速、稳定地反应小麦谷朊粉品质差异。     

朊蛋白基因敲除无启动子打靶载体的构建策略

基因敲除是建立在同源重组技术基础之上的一种定点修饰基因组的实验方法,其与体细胞核移植技术的成功结合,已经成为一种有效的定点修饰、改造大动物基因组DNA片段的实验策略。朊蛋白是传染性海绵状脑病的致病蛋白。目前,在小鼠和绵羊中已经成功获得朊蛋白基因敲除的动物,但在牛中尚未有成功的报道。文章旨在介绍牛朊蛋白基因敲除无启动子打靶载体的构建过程及技巧,以为将来利用核移植技术生产敲除朊蛋白基因的克隆牛提供依据。     

茶树β-葡萄糖苷酶cDNA克隆和原核表达

摘要：对与萜烯类香气前体及与抗病虫害有密切关系的茶树(Camellia sinensis ) β-葡萄糖苷酶cDNA进行克隆和原核表达。结果表明，该酶cDNA全长序列为1 475 bp(GenBank登录号为AF537127)，与其它植物同源性为40%～60%。α-螺旋构象14.33%、β-折叠构象25.43%，存在多个氨基酸功能结构域。利用pET-32a表达载体构建的重组质粒，转化到大肠杆菌(Escherichia coli )菌株BL21zztrxB（DE3）中，诱导产生63 kD的融合蛋白，表达产物具有正常的生物学活性，能催化葡萄糖苷键的水解反应；诱导表达结果显示，主要在细胞质中以可溶性蛋白形式进行表达。     

骨胶原蛋白-壳聚糖共混膜中分子间作用红外光谱分析

本研究旨在利用二维红外相关光谱探讨共混膜中骨胶原蛋白和壳聚糖分子间相互作用。采用分峰拟合和二维相关分析法分析了不同混合比例共混膜的红外光谱特征。结果表明,随着壳聚糖添加量增大,骨胶原蛋白的C=O键构象首先变化,二级结构伸展,基团暴露;壳聚糖的脱乙酰化程度较高,糖基骨架C–O–C键的二维红外相关峰表明成膜过程中壳聚糖的空间构象发生改变。添加壳聚糖后,N-H键振动光谱变化十分显著;胶原蛋白的-OH、-NH2、-COOH与壳聚糖的-NH2和-COOH等基团形成分子间氢键;壳聚糖侧链-NH2质子化形成-NH3+后与胶原蛋白形成静电作用。研究表明,胶原蛋白与壳聚糖分子间形成氢键和静电相互作用,为进一步从分子层面上研究分子间相互作用提供参考。     

~(60)Co-γ辐照对花生过敏原Ara h 2蛋白构象及致敏活性的影响

为探讨辐照处理对花生Ara h 2蛋白结构与致敏活性的影响,采用不同剂量~(60)Co-γ辐照处理分离纯化所得到的花生过敏原Ara h 2蛋白,结合紫外扫描光谱、圆二色谱(CD)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评估辐照处理后Ara h 2蛋白的结构变化,并用免疫印迹法和间接酶联免疫吸附法检测辐照处理后Ara h 2的抗原性变化。结果表明,~(60)Co-γ辐照处理可以显著改变花生Ara h 2蛋白的构象,使其降解、发生交联。随着辐照剂量的增大,Ara h 2蛋白与抗体的结合能力呈逐渐下降趋势,且与蛋白紫外吸光度的增强和α-螺旋含量的降低呈现良好的相关性。当辐照剂量为10 kGy时,可基本破坏Ara h 2蛋白的结构和免疫活性。~(60)Co-γ辐照处理可以有效降低花生过敏原Ara h 2蛋白的致敏性,这为花生脱敏技术的研究提供了新思路。     

甜高粱茎秆残渣生料多菌种固态发酵生产蛋白饲料

为实现甜高粱茎秆残渣生产蛋白饲料的规模化应用,该研究将黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei),产朊假丝酵母(Candida utilis)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)进行优化组合,添加不同质量分数尿素对甜高粱茎秆残渣进行生料固态发酵生产蛋白饲料。试验通过对比发酵前后粗蛋白、真蛋白、粗灰分和粗脂肪质量分数变化发现:添加4种菌的复合菌株,再添加1%尿素发酵8 d后能使以甜高粱茎秆残渣为底物的饲料中纤维素由33.00%降低至24.09%,半纤维素由20.99%降低至17.69%;粗蛋白质量分数由2.27%提升至7.14%,真蛋白由2.01%提升至6.41%。该研究简化了甜高粱秸秆残渣规模化生产饲料蛋白的工艺,为该工艺的推广应用奠定基础。     

脉冲电场对果胶酯酶的活性及构象的影响

为了采用非热杀菌技术以保持果汁的新鲜度,研究了高压脉冲电场(PEF)对果胶酯酶(PE)的活性及酶构象的影响效果。结果表明PEF可以钝化PE的活性：随脉冲电场电场强度的增强(5～25 kV/cm)和脉冲数的增加(207～1449个)PE酶活钝化效果增强;在PEF处理后立刻测定发现25 kV/cm、1449个脉冲时,PE酶活性最高降低了65.3％。PE酶活变化与PEF电场强度和脉冲数之间存在良好的线性相关,R²分别达到0.988和0.953。PEF处理(621个脉冲)后PE的荧光强度增加,整体变化趋势是随电场强度增强荧光强度先增加后下降,但荧光强度值都低于热处理(100℃处理5 min)后酶蛋白的荧光强度值。因此PEF可以有效钝化果胶酯酶的活性,并且改变果胶酯酶的构象。     

利用噬菌体随机肽库筛选传染性法氏囊病病毒VP2模拟表位

用纯化的4株传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2单克隆抗体(1B5,5D1,2H11和I4-4-3)筛选噬菌体随机12肽库,对40个克隆(10个单克隆噬菌斑×4株单克隆抗体)进行ELISA验证,获得32个阳性克隆,选20个阳性克隆(5个单克隆噬菌斑×4株单克隆抗体)进行DNA序列分析,确定了4个优势12肽为不同传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗原表位.这4个12肽在一级结构上没有3个以上连续氨基酸与GenBank中传染性法氏囊病病毒、VP2的氨基酸序列相同之处,与单抗的结合可被VP2蛋白有效地抑制,推测可能是构象依赖性表位.将4个模拟表位串联表达后获得目的蛋白,经SDS-PAGE分析,目的蛋白占菌体总蛋白的20%,分子量30 kD.用多克隆抗体对目的蛋白进行免疫印迹分析,结果表明目的蛋白具有特异性和反应原性.试验结果提示:筛选的是传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2单抗的模拟表位.