线粒体DNA的研究与应用

国内外对线粒体DNA（MtDNA)进行了大量的研究，取得了丰硕的成果，但仍有很多问题值得进一步的研究和探索。本文就线粒体研究的热点，简要介绍线粒体DNA的结构、功能、遗传特性、线粒体基因与核基因组的相互关系，同时概述线粒体基因组的进化及其在真菌的系统分类学应用中所取得的一些进展。对未来线粒体DNA的研究提出了一些看法。     

水稻线粒体基因组水平上的蛋白质编码基因克隆方法研究

为探索适用于水稻线粒体基因的克隆方法,以水稻线粒体基因ccmB、nad9为例,分别选用3种不同的方法进行克隆。在对水稻线粒体基因组蛋白质编码基因进行比对分析的基础上,探讨了各种克隆方法的优劣及适用范围。结果表明:常规方法适用于Ⅰ类水稻线粒体基因的克隆,RT-PCR法适用于Ⅱ类水稻线粒体基因的克隆,简易方法只适用于Ⅲ类水稻线粒体基因的克隆。     

林麝肺成纤维细胞线粒体全基因组结构特征及遗传变异分析

林麝(Moschus berezovskii)是一种具有较高经济价值和药用价值的保护野生动物。为深入研究林麝线粒体基因组的结构特征及遗传变异,基于Illumina NovaSeq平台对林麝肺成纤维细胞FMD-C1线粒体进行全基因组测序,并进行特征注释、结构预测、序列分析和系统发育重建。结果显示,FMD-C1线粒体基因组序列全长为16 351 bp,共有13个蛋白编码基因(protein coding gene, PCG),22个tRNA,2个rRNA和两段非编码区,具有明显的AT偏好性。将序列上传至GenBank,登录号为MW879208。与NCBI上林麝的其余序列比对,FMD-C1的4个PCGs中检测出5个单氨基酸突变和3个插入氨基酸;D-loop区检测出19个差异碱基和2个碱基缺失。系统进化分析发现与林麝亲缘关系最近的是安徽麝。研究结果可为林麝的选育和遗传多样性保护提供参考依据,也为进一步探讨林麝肺部疾病线粒体水平的致病机制奠定基础。     

喹乙醇致线粒体DNA基因损伤的SSCP分析

为研究喹乙醇对mtDNA基因的致突变效应,以1日龄的健康艾维因商品代肉鸡为试材,运用改进的碱变性法提取肝脏的mtDNA,设计4对引物扩增mtDNA的tRNALeu(UUR)t、RNAIlet、RNALys、ATPase8 4个基因,同时运用SSCP技术对扩增产物进行突变分析。结果表明:喹乙醇处理Ⅵ组tRNALeu(UUR)有突变发生,序列测定结果表明该突变为4 007位的C→A点突变,其他各组的tRNALeu(UUR)基因无任何突变发生。该结果提示喹乙醇中毒可以导致mtDNA tRNALeu(UUR)基因突变。     

基于线粒体DNA全序列11个蛋白编码基因拼接序列的鳞翅目昆虫系统发育研究

目前已测定线粒体DNA全序列的鳞翅目昆虫有12种。由于高变异性和强核苷酸组成偏好性,去除了两个蛋白基因和两个物种,最终以10个鳞翅目物种的11个蛋白编码基因拼接序列对鳞翅目分子系统发育关系进行了研究。与前人的结果一致,基于11个蛋白编码基因拼接序列数据所构的最大似然树支持鳞翅目,鳞翅目内各总科和各科均为单系群。与MINET[1]基于形态学数据的结果相同,各总科的系统发育关系为{卷蛾总科+[螟蛾总科+(尺蛾总科+蚕蛾总科)]}。蚕蛾总科内各科系统发育关系类似于REGIER等[2]的结论。     

线粒体DNA的遗传与动物进化研究

 大多数学者认为脊椎动物的线粒体DNA遗传是严格的母系遗传,因而mtDNA分析成了动物进化研究中广泛采用的分类工具,为了和严格母系遗传相一致,以至于“精子线粒体被删除丢失”的说法被人视为存在而得以传播,因为这种说法支持了人类起源于非洲的“非洲夏娃”理论模式。而且线粒体母系遗传模式在假说争论中从未受到真正挑战。本文通过阐述动物线粒体DNA母系遗传假说在动物进化研究中的不严谨性,推测脊椎动物的线粒体DNA的遗传可能不是严格的母系遗传,而是一种随机性的遗传方式。     

猫科动物线粒体DNA研究进展

综述了线粒体DNA在猫科动物的系统进化关系与分类地位、物种的遗传多样性、群体遗传结构以及物种识别等方面的研究现状，并提出今后应对野生猫科物种的mtDNA全基因组测序，以及对某些与mtDNA基因相关的疾病等进行深入研究。     

昆虫线粒体DNA在分子进化研究中的应用

阐述了昆虫线粒体DNA在分子进化中的研究进展,包括昆虫线粒体DNA的组成和各部分的进化特点,以及线粒体DNA在昆虫系统学中的应用情况,并对今后的深入研究提出了建议。     

动物线粒体基因与进化研究进展

与动物细胞核DNA相比,线粒体DNA在遗传上具有自主性,很容易从组织中提取,且重复性好。线粒体基因组遗传特点的研究,已成为真核生物分子遗传学、发育生物学和分子系统进化领域中的一个重要模式体系。通过分析线粒体基因组的结构成分和遗传特点,阐述了线粒体DNA在进化遗传学方面的应用。     

鹿科动物线粒体DNA序列差异和系统进化关系

从Gen Bank数据库中获得20种鹿科动物的线粒体DNA序列全长,分析了序列碱基含量和遗传距离关系,并构建系统进化树,探讨了鹿科动物的系统进化关系。序列分析表明:鹿科动物线粒体DNA全长为16 305~16 482 bp,A+T含量约占62.58%,各物种间遗传距离为0.014~0.164。系统进化分析表明:驼鹿在鹿科动物中可能是最古老的;麋鹿与鹿属亲缘关系较近,支持将麋鹿划到鹿属的观点;泽鹿与花鹿属的斑鹿和豚鹿先聚到一起,支持将泽鹿划到花鹿属中;麂亚科中小麂可能是最原始的,赤麂和黑麂亲缘关系较近;獐与狍亲缘关系更近,建议将獐与狍划归到一个亚科。     

柞蚕线粒体Cyt b基因片段的序列多态性分析

以22个柞蚕品种（品系）为材料,采用PCR技术分别扩增其线粒体DNA（mtDNA）的细胞色素b基因（cytb）,测定5’端485bp的核苷酸序列,并采用Dnaman软件进行分析,结果表明：供试22个柞蚕品种可分成2组,2组之间只在294bp处有一个差异位点。从GenBank中调取柞蚕豫早1号品种Cyt b基因的5’端相应序列（AY242996）,与本试验测得的柞蚕青黄1号和青6号对应的核苷酸序列进行了同源性比较。结果表明：青黄1号和青6号的同源性达99．8％,青黄1号和豫早l号的同源性达98．6％,青6号和柞早1号的同源性达98．8％。可见,不同柞蚕品种的表型虽然不同,但在cytb基因水平上其核苷酸序列的组成却是高度一致。供试品种间的亲缘关系很近,同源性较高。     

上海地区实验用兔线粒体DNA-RFLP分析

提取3个品种实验用兔肝组织中的线粒体DNA,并用ApaI等21种限制性内切酶进行消化。分析上海地区实验用兔mtDNA的多态性。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测,共检出8种不同的限制性单倍型,少数个体出现的差异,可能来源于几个位点发生偶然突变,但不同兔群的限制性无规律性。结果表明上海地区实验用兔群体mtDNA的遗传多样性贫乏,遗传结构单一,提示所研究的兔种可能有共同祖先,或人工饲养繁殖出现血缘杂交现象。     

柑橘线粒体DNA高效提取及RAPD分析

以柑橘胚性愈伤组织为试材,采用差速离心结合蔗糖衬垫法建立了柑橘线粒体快速、高效分离纯化技术体系,得到的线粒体完整,具有很强的荧光活性.利用SDS法提取、纯化的线粒体DNA(mtDNA)经紫外分光光度计分析,A260mm/A280nm值为1.80、A260nm/A230nm值为1.95;0.7%琼脂糖电泳检测获得的谱带清晰,长度在20 kb左右,无降解.本研究建立的方法与通常采用的密度梯度离心法相比,具有耗时短、对离心机的要求不高,且所提取的mtDNA产率高、结构完整等特点.以建立的技术体系提取7个柑橘品种的mtDNA进行RAPD分析,均扩增出清晰、多态性好的谱带,大小分布在250～2000bp之间.     

云南绵羊mtDNA D—LOOP序列多态性研究

采用 PCR-SSCP 技术与 mtDNA D-Loop 序列分析相结合的方法,对我国云南昭通绵羊、腾冲绵羊、宁蒗绵羊 3 个地方绵羊品种共 134 个个体进行 mtDNA 序列多态性及起源进化研究.PCR-SSCP 分析显示,在云南的 3个绵羊群体中检测到线粒体编码区的 Cytb 和 ND2 基因的 2 种单倍型 A 和 B.根据不同的单倍型从 3 个绵羊群体中共筛选出 23 个样品进行了 mtDNA D-Loop 区克隆测序,系统发育分析揭示,云南绵羊 mtDNA D-Loop 序列单倍型分为支系 A 和支系 B 两大类.基于 PCR-SSCP 和 D-Loop 区序列的分析结果一致提示云南绵羊存在支系 A 和支系B两大母系起源,对云南绵羊进行 mtDNA D-Loop 序列多态性分析,结果发现线粒体 D-Loop 区系列单倍型多样度删为 87.5%～100%;核苷酸多样度只为 0.21～0.26;平均核苷酸差异数 K 为 22.9%～36.8%.此结果揭示云南绵羊遗传多样性相对贫乏.对云南绵羊 mtDNA D-Loop 进行 Mismatch 分析和 Tajima's 值中性检验,结果显示,云南绵羊群体核昔酸差异数表现出完整的 2 个峰形,且经过中性检验不显著,由此推断云南绵羊在过去没有出现群体扩张,群体大小保持稳定.     

3个罗非鱼品系的线粒体DNA遗传多态性研究

应用mtDNA标记技术对3个罗非鱼品种(系)(吉富品系尼罗罗非鱼、美国品系尼罗罗非鱼、埃及品系尼罗罗非鱼)的DNA多态性进行研究.研究结果如下:(1)测定3个品种的罗非鱼mtDNA Cytb基因的一段长为435 bp的序列.发现2个碱基发生转换,1个氨基酸被替换;(2)将3个品种的罗非鱼mtDNA Cytb基因部分序列与马氏蛰丽鱼、迪氏康尼丽鱼、洛氏帚齿非鲫、加利略帚齿非鲫、彩虹鲷、莫桑比克共9个个体的mtDNA Cytb基因进行同源序列分析,系统关系可表示为:[(尼罗罗非鱼,莫桑比克罗非鱼),马氏蛰丽鱼],这与传统的分类学结果一致.     

五指山猪线粒体基因组全序列测定与分析

采用PCR及TA克隆测序技术,获得五指山猪线粒体基因组全序列(KJ909516),并对其特征进行具体分析。结果表明,五指山猪线粒体基因组序列全长16 689bp,碱基组成为A(34.7%)、C(26.2%)、G(13.3%)、T(25.8%),包含13个蛋白编码区,2个rRNA,22个tRNA和1个非编码控制区(D-Loop区)。13个蛋白质编码基因中,ND2、ND3和ND5起始密码子为ATA,ND4L起始密码子为GTG,其余均为ATG。蛋白编码基因ND1和ND2终止密码子为TAG,Cyt b终止密码为AGA,COXⅡ、COXⅢ、ND3和ND4的终止信号为不完全密码子T,其余均为TAA。22个tRNA中除tRNASer(AGY)缺少DHU臂外,其余tRNA均可形成典型三叶草结构。线粒体控制区全长1 254bp,含有22个长度为10bp的串联重复序列ACGTGCGTAC。5种中国小型猪蛋白质编码基因的比对结果说明,五指山猪在ND2和ND5基因上与其他4个猪种存在明显差异,可为能量代谢差异研究提供分子学依据。     

德国骑乘马线粒体DNA的限制性酶分析

通过５种限制性内切酶获得了１３匹德国骑乘马线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）的切割图谱。结果发现,限制性消化产生了１（ＥｃｏＲⅠ）,３（ＢｇｌⅡ）,４（ＢａｍＨⅠ）或５个（ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ）限制性片断,并确定了所有片断的分子大小。ｍｔＤＮＡ总的大小平均为（１６．４８±０．１０）ｋｂ．除ＢａｍＨⅠ外,ｍｔＤＮＡ的限制性切点对于所有的个体是完全一致的。用ＢａｍＨⅠ检测到ｍｔＤＮＡ的多态性,通过带谱分析推断,德国骑乘马的Ｂ型ｍｔＤＮＡ是由Ａ型ｍｔＤＮＡ通过突变产生１个新的切割位点进化而来。     

不结球白菜线粒体DNA的提取及分析

采用SDS-蛋白酶K法提取了不结球白菜黄化苗的线粒体DNA,经琼脂糖电泳及紫外分光光度分析表明,所提取的DNA纯度高,足以进行后续的研究工作.以所提取的线粒体DNA为PCR进行RAPD扩增,获得了清晰的扩增图谱.     

关中奶山羊线粒体Cyt b基因遗传多样性研究

测定了关中奶山羊品种10个个体的细胞色素b基因全序列(1 140bp),比较分析了群体中细胞色素b基因的碱基组成和序列间碱基的变异情况,结果表明:在该品种(群体)中细胞色素b基因序列中10个变异位点上观察到17次T-C间的碱基转换,除了有1次T-C间碱基转换发生在密码子第1位点以外,其余的16次碱基转换都发生在密码子第3位点,均为同义突变;观察到5种单倍型,单倍型多样度为0.756。并以绵羊为外群构建系统发生树(NJ树),结果显示:关中奶山羊有2个母系起源,其中支系A占90%(9/10),支系B占10%(1/10)。