牙鲆胚胎程序化冷冻保存研究

以牙鲆胚胎为材料,对胚胎程序化冷冻保存的主要环节进行了探讨,以优化牙鲆胚胎的程序化超低温冷冻保存法。单一抗冻剂的毒性试验表明甲醇(Methanol)、1,2-丙二醇(PG)的毒性低于其他抗冻剂的毒性。混合抗冻剂的毒性试验表明,20%~25%PM抗冻剂的毒性很低,经其平衡处理的胚胎,冷冻至-30℃,成活率可达80%以上。植冰前采用2℃/min的降温速率,从植冰后到入液氮前温度采用8℃/min的降温速率效果较好。入液氮前温度的筛选实验表明,入液氮前的温度以-45℃较好。利用20%PM和22%PMP,采取优化的降温程序冷冻保存尾芽期的牙鲆胚胎,分别获得5枚和7枚复活胚胎,并全部孵化出膜。     

不同抗冻剂对牙鲆胚胎毒性研究以及玻璃化颗粒冷冻保存方法的应用

以牙鲆(Paralichthys olivaceus)不同发育期胚胎为实验材料,研究了7种渗透性和5种非渗透性抗冻剂对牙鲆尾芽期和心跳期胚胎的毒性,同时对玻璃化液在不同胚胎发育期的毒性作用,以及玻璃化颗粒冷冻过程中,冷冻颗粒降温和解冻的时间进行了研究。结果表明,单一渗透性抗冻剂对牙鲆胚胎的毒性随着抗冻剂浓度的升高、平衡时间的延长而提高,其毒性由大到小依次为乙二醇(EG)、酒精(EtOH)、甘油(Gly)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇(MeOH)、1,2-丙二醇(PG)。非渗透性抗冻剂中聚乙烯吡咯酮(PVP)对牙鲆尾芽期胚胎的毒性最强,其次是蔗糖和D果糖,葡聚糖和葡萄糖毒性最弱。在总体积分数一定的情况下,PG、MeOH与DMSO体积比为9∶6∶5的混合抗冻剂对牙鲆尾芽期胚胎毒性最低;各发育期胚胎经过玻璃化液平衡后,尾芽期以前胚胎的成活率随胚胎发育期逐渐升高,心跳期以后逐渐降低,尾芽期和心跳期成活率最高。含胚胎的玻璃化颗粒冷冻降温时间最短为15.09 s,解冻时间最短为6.22 s;而不含胚胎的玻璃化颗粒冷冻降温和解冻时间分别为(13.83±1.86)s和(7.20±0.90)s。将PG、MeOH与DMSO按体积比9∶6∶5配成总体积分数为35%的混合溶液,再添加5%的蔗糖配制成玻璃化液,采用此玻璃化颗粒冷冻方法对173粒牙鲆尾芽期至心跳期胚胎进行超低温冷冻保存,解冻后共获得4粒成活胚胎。     

大菱鲆胚胎的玻璃化冷冻保存

Vitrification solutions were examined for their suitability of cryopreservation of turbot (Seophthulnms maximus) embryos. PMPI gave higher survival rate (75.68%) than other vitrification solutions and was considered to be suitable liar the cryopreservation of turbot embryos. The freezing point of the vitrification solutions consisted of PG and MeOH in the proportion of 3:2 was measured when the vitrification solutions were cryopreserved. It showed that the vitrification solutions with a cryoprotectant concentration of over 41% have no freezing point and the freezing points of vitrification solutions containing 33.33%-40% cryprotectants were between -32.4℃ and -65.4℃, The freezing point decreased with the increase of cryoprotectant concentration. The resistance of turbot embryos at different stages to the cryoprotectants was studied, It was found that the turbot embryos from 4-5 pairs somite to tail bud were more resistant to cryoprotectants and suitable to vitrify. A live embryo was obtained after cryopreservation in liquid nitrogen for 14h and was hatched out。     

泥鳅胚胎玻璃化液超低温冷冻保存研究

泥鳅胚胎（胚孔封闭期）用10＃玻璃化液作为低温保护剂，经低温（－196℃）冷冻保存17h后，38℃水浴解冻，解冻后的胚胎获得了成活。在稀释液B1、B2、B3中分别有26．7％，15．0％，3．0％成活的胚胎。解冻后的胚孔封闭期胚胎经过50h的培养，胚胎从胚孔封闭期发育至尾鳍出现期。     

中华绒螯蟹胚胎的玻璃化冷冻保存

研究了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)4个不同发育时期胚胎对A号玻璃化液的耐受性和玻璃化冷冻保存。结果表明,不同时期的胚胎对玻璃化液的耐受能力不同,其中卵裂期胚胎对玻璃化液的耐受能力较差(20~30 min),前无节幼体期和原溞状幼体期胚胎在玻璃化液中的适应时间较长(40~60 min);随着平衡时间的延长,中华绒螯蟹各个时期的胚胎成活率逐渐下降。中华绒螯蟹前无节幼体期胚胎在A号玻璃化液中平衡40 min,0.25mol/L的蔗糖分别洗脱5、10、15、20 min后,胚胎成活率无显著性差异(P>0.05)。前无节幼体期胚胎在A号玻璃化液中平衡40 min,在–196℃冷冻40 min,快速解冻后用0.25 mol/L的蔗糖洗脱10 min,有8个胚胎成活,成活率为(9.3±2.5)%,胚胎培养至第4天死亡;原溞状幼体期胚胎在A号玻璃化液中平衡40 min,在–196℃冷冻35 min,经相同浓度的蔗糖洗脱相同的时间,有7个胚胎成活,成活率(11.3±3.6)%,培养至第6天时,1个胚胎孵化出膜,出膜胚胎成活1d后死亡。     

牙鲆胚胎玻璃化冷冻及解冻过程中的温度因子与玻璃化率

为避免鱼类胚胎玻璃化冷冻过程中脱玻璃化现象发生,本文对冷冻过程中温度变化及解冻方法进行了研究.在室温13℃下,将含有玻璃化液FVS3的麦管直接投入到-196℃的液氮中,麦管内温度达到-196℃时,所用的时间为15.46±1.38s,降温速率为800℃/min.对玻璃化麦管在35～45℃水浴中解冻时间进行测定.结果显示,解冻所需时间在6.17～7.94s之间,麦管从-196℃升高到13℃的解冻速率为1500～2000℃/min.当水浴温度从37℃逐步升高到72℃时,对水浴表面蒸气温度的变化进行了测定,相应水温下蒸气温度从25.47℃升高到38.6℃.在麦管中加入不同浓度的玻璃化液FVS1、FVS2、FVS3和FVS4进行玻璃化冷冻,然后将麦管分别在37℃水浴中和28.6℃的蒸气中解冻时玻璃化率进行研究.结果显示,在蒸气中解冻时的玻璃化率明显高于水浴中解冻;麦管玻璃化率在水浴中解冻时不稳定,在蒸气中解冻时表现稳定,玻璃化率随着玻璃化液浓度的升高有逐渐升高的趋势.对含有牙鲆胚胎的玻璃化冷冻麦管分别在37℃水浴和28.6℃蒸气中解冻,结果表明,蒸气中解冻时的玻璃化率同样明显高于水浴中解冻.     

鱼类胚胎低温冷冻保存降温速率研究

在低温下采用慢速降温速率，以０．２－０．５℃／分降至－４０℃以上温度，胚胎获得２０％以上成活率。在超低温下采用快速降温速率，以２℃／分降至－４０℃，再以１０℃／分降至－１９６℃，胚胎获得了９０％以上复活率。     

中华鲟胚胎细胞的冷冻保存及其核移植

为了保存濒危鱼类中华鲟种质资源,对其囊胚细胞和原肠细胞进行了冷冻保存和核移植试验。用二甲亚砜(DMSO)、1,2-丙二醇(PG)、羟乙基淀粉(HES)3种抗冻剂,配制4种冷冻保护液:CP1(12%D)、CP2(10%P)、CP3(8%D 6%E)、CP4(7%P 6%E),冷冻细胞存活率分别为47.4%±4.7%、64.4%±3.6%、54.7%±4.7%、76.7%±5.7%,CP4保存效果最好,说明添加非渗透型抗冻剂羟乙基淀粉能提高冷冻保存细胞的存活率。比较了两种冷冻方法,发现细胞在-7℃平衡30min之后直接投入液氮的一步冷冻降温法是可行的。对不同发育时期的胚胎细胞冷冻存活率进行了比较,结果表明原肠细胞冷冻存活率(64.4%±11.8%)明显比囊胚细胞的(57.1%±11.2%)高(P<0.05)。用冷冻复苏后的囊胚细胞和原肠细胞作供体,以中华鲟未受精卵作受体进行核移植,各移植了469和392枚卵,分别获得了5尾和2尾克隆鱼,核移植成功率分别为1.1%和0.5%。表明可通过冷冻保存胚胎细胞结合核移植技术保存鱼类种质资源。     

卤虫胚胎和无节幼体超低温冷冻保存的研究↑（*）

用玻璃化液作为低温保护剂，对卤虫胚胎和无节幼体进行超低温冷冻保存实验。通过实验筛选出５种适宜卤虫胚胎保存的玻璃化液，找出了影响胚胎成活的降温温层和升温温层，使胚胎经－１９６℃保存后的成活率稳定在９０％。建立了较为完善的卤虫胚胎冷冻保存的程序。卤虫无节幼体经超低温冷冻保存后，获得３－５％的成活率。     

牙鲆胚胎及其初孵仔鱼的盐度耐受力

实验盐度设置为５,１０,１５,２０,２５,３０,３５,４０,４５,５０。当盐度为５～３５时,牙鲆（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉ－ｖａｃｅｕｓ）胚胎的孵化率都高于９５％;仔鱼体态正常,７２ｈ后的存活率高于９５％。刚孵化的仔鱼在低盐度下的体长较长,但７２ｈ后,没有明显差异（Ｐ〉０．０５）。自然条件（盐度为３２）孵化的仔鱼转移到不同盐度的溶液中,在盐度５～４５内,仔鱼的存活率高于５０％。实验初步表明     

牙鲆苗种繁育技术

牙鲆(Paralichthysolivaceus)人工繁育技术的研究和开发,日本早在2 0世纪60年代就已经开始,我国1 992年之后牙鲆人工养殖业迅猛发展。但近年来出现了卵的受精率低、苗种成活率低、白化与黑化比例提高、养成过程死亡率高、优良性状退化等现象。为改变上述现状,必须从亲鱼培育着手,并严格执行健康苗种技术操作规程,从而取得较好的成效,现将具体技术介绍如下:1　材料1 .1　培育设施　亲鱼培育池30～75m3,深1～1 .5m ,水深0 .8～1m ;水泥池30～45m3/个,可作为亲鱼产卵池、孵化池、仔鱼培育池;饵料生物培养池1 2～1 8m3;沉淀池5 0 0m3;一级、二…     

有丝分裂雌核发育牙鲆的微卫星鉴定

通过静水压抑制卵裂方法获得多个牙鲆(Paralichthys olivaceus)有丝分裂雌核发育家系,在仔鱼阶段经历大批死亡后,将各个家系残存的个体混合饲养,24个月后获得1批存活个体。利用11对微卫星分子标记,对173尾有丝分裂雌核发育牙鲆进行分析,结果表明,其中111尾在11位点全部纯合,62尾在部分位点杂合,平均杂合子比例为0.2338。11个位点的等位基因数为4～8,平均等位基因数为5.0336,有效等位基因数为2.0421～5.1268,平均有效等位基因数为3.2815。采用NJ法对111尾纯合牙鲆的亲缘关系进行聚类分析,可分为4群。微卫星标记鉴定结果表明,通过静水压抑制卵裂法可以获得完全纯合的牙鲆,但有部分杂合个体出现。分析其原因,可能是由于某些卵子发育不同步,静水压抑制其第二极体排出而非全部抑制卵裂,导致减数分裂雌核发育所致。     

褐牙鲆♀×大西洋牙鲆♂杂交育种研究

为探讨褐牙鲆和大西洋牙鲆杂交育种的可行性，通过繁殖调控使褐牙鲆和大西洋牙鲆同步性成熟，采取正反交试验，获得了褐牙鲆（♀）×大西洋牙鲆（♂）杂交F1代——花关牙鲆（Paralichthysolivaceus早×Pdentatus6）。花关牙鲆受精卵卵径平均1．01mm；孵化适宜温度15—21℃，盐度25～35，孵化率平均71．3％，初孵仔鱼全长2．5～2．7mm；仔鱼在16—20℃下36d后伏底变态，变态个体全长平均11mm，育成率32．5％；反交受精率和孵化率极低，未获得杂交后代。简述了其发育时序和形态特征，探讨温度、盐度对花关牙鲆胚胎和仔鱼发育的影响，比较亲本与杂交鱼早期生长特征，初步分析反交不成功的原因。     

褐牙鲆♀×大西洋牙鲆♂杂交育种研究

为探讨褐牙鲆和大西洋牙鲆杂交育种的可行性,通过繁殖调控使褐牙鲆和大西洋牙鲆同步性成熟,采取正反交试验,获得了褐牙鲆(♀)×大西洋牙鲆(♂)杂交F1代——花美牙鲆(Paralichthys olivaceus♀×P.dentatus♂)。花美牙鲆受精卵卵径平均1.01mm;孵化适宜温度15～21℃,盐度25～35,孵化率平均71.3%,初孵仔鱼全长2.5～2.7mm;仔鱼在16～20℃下36d后伏底变态,变态个体全长平均11mm,育成率32.5%;反交受精率和孵化率极低,未获得杂交后代。简述了其发育时序和形态特征,探讨温度、盐度对花美牙鲆胚胎和仔鱼发育的影响,比较亲本与杂交鱼早期生长特征,初步分析反交不成功的原因。     

3种工业废水对牙鲆胚胎的毒性效应

通过室内实验，研究了印染废水、电镀废水、农药废水3种工业废水及其混合物(等体积混合)对牙鲆胚胎的毒性效应。印染废水的主要有毒物为苯胺(20mg/L)和苯酚(24mg/L)，电镀废水主要有毒物为锌(1970mg/L)、铜(9mg/L)和铅(7．5mg/L)；农药废水及混合物主要有毒物为久效磷和亚磷酸盐。实验表明，这4种类型废水对牙鲆胚胎发育孵化有显著影响的最低体积分数分别为0．5％、0．15％、0．25％和0．25％；对牙Gf胚胎起始半数致死浓度(95％可信限，体积分数)分别为3．38％(2．29％—3．87％)、0．81％(0．71％—0．92％)、1．57％(1．37％—1．82％)和1．48％(1．24％—1，76％)。以牙鲆胚胎起始半数致死浓度(体积分数)为指标，这几种工业废水的毒性顺序为电镀废水＞农药废水＞印染废水。     

Dietary choline requirement of juvenile olive flounder (Paralichthys olivaceus)

An eight‐week study was conducted to determine the optimum dietary choline level in juvenile olive flounder, Paralichthys olivaceus. Seven diets were prepared to contain 0, 250, 500, 750, 1,000, 2,000 and 3,000 mg/kg diet. Juveniles (5.9 ± 0.03 g; 5.5 ± 0.4 cm; mean ± SD) were randomly distributed into 21 tanks (25 fish/tank) and fed one of the diets in triplicates. Survival rate of fish fed the diet containing the lowest choline level was significantly lower than those of fish fed the other diets (p < 0.05). Final body weight, weight gain, specific growth rate, feed efficiency and protein efficiency ratio significantly increased with increasing choline levels up to 1,000 mg/kg diet. Whole‐body protein and lipid contents increased in accordance with choline levels up to 750 mg/kg diet, beyond which they plateaued. Liver and muscle lipid contents elevated with increasing choline levels up to 2,000 mg/kg diet. Plasma cholesterol esters, triglycerides, cholesterol and total lipids were significantly influenced by the graded choline levels; however, responses of those indices were not identical. Broken‐line analyses of weight gain and liver choline concentrations responding to the graded choline levels revealed that choline requirements of the juvenile flounder could be between 847 and 1,047 mg/kg diet.     

褐牙鲆水中阻力的初步研究

鱼类在水中游泳时,需要克服水的阻力从而需要消耗一定的能量.鱼类依鱼种、大小以及形态特征的差异,在同样的水流条件或游泳速度下,其水中阻力也不相同.本研究通过对褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)在垂直循环水槽中进行游泳阻力测试实验,分别用3种特征面积(横截面积、湿表面积和鱼体体积的2/3次方),获得褐牙鲆3种不同的阻力系数.经比较分析发现,在雷诺数Re为2.7×104～1.91×105时,采用湿表面积作为褐牙鲆的特征面积获得的阻力系数的平均值为0.020,此时标准差最小,仅为0.000 76.而分别用横截面积和鱼体体积的2/3次方时获得的阻力系数的标准差相对较大.因此,用褐牙鲆的湿表面积计算得到的阻力系数更适合于该种鱼类个体水中阻力的研究.     

养殖牙鲆淋巴囊肿病及防治

近年来,我国工厂化养殖牙鲆鱼规模不断扩大,随之而来的病害也日趋增多。2004年天津市病害测报中淋巴囊肿病是牙鲆鱼主要病害之一,该病是牙鲆工厂化养殖的高发病,我市测报牙鲆淋巴囊肿病发病面积1246m^3,累计发病率13．76％,经济损失逾百万元。牙鲆淋巴囊肿病可导致工厂化养殖大面积暴发流行,感染率高,损失惨重,因此加强病害综合防治非常重要。