龙眼胚性悬浮细胞原生质体培养及其体胚发生再生植株

以“红核子”、“东壁”、“十二月龙眼”等龙眼品种的胚性悬浮细胞为起始材料分离原生质体,采用液体浅层培养、包埋悬浮培养等方式,进行原生质体培养与植株再生研究。研究结果表明,海藻酸钙包埋悬浮振荡培养(50r/min)是龙眼悬浮细胞原生质体培养的适宜培养方式,在含有多种生长调节剂的改良MS培养基(MP6)上,再生小克隆的形成频率可高达5%;采用龙眼胚性愈伤组织体胚诱导、成熟和萌发的优化方案,原生质体再生小克隆分化子叶形胚状体的频率达100%,萌发植株的频率一般大于45%。      

龙眼胚性愈伤组织miR398a前体的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

为了解miR398a在龙眼体胚发生中的调控机制,以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR法克隆miR398a前体序列,最终成功克隆了长83 bp的龙眼miR398a前体序列(GenBank登录号:FJ973472);该前体与其它物种的miR398前体序列具有较高的同源性,并包含miR398a的成熟序列;利用qPCR技术研究该基因在龙眼体胚发生发育过程中的表达情况,定量分析结果表明,随着龙眼体胚的发育,pre-miR398a在不同胚性培养物中的转录水平存在显著差异:在不完全胚性紧实结构表达量最高,球形胚阶段次之,随后是胚性紧实球形结构、胚性愈伤组织II及松散型胚性愈伤组织,在心形胚、鱼雷形胚阶段和子叶形胚阶段表达量较低。说明pre-miR398a在龙眼体胚发生过程中的表达具有组织特异性和一定的时序性。     

龙眼胚性愈伤组织miR398b前体克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料,对miR398b前体进行克隆,并分析其在龙眼体胚发生过程中的表达。结果表明:获得长85 bp的龙眼miR398b前体序列(GenBank登录号:GU968639),该前体与葡萄、毛果杨的miR398b前体序列具有较高的同源性,并包含长21 bp的miR398b成熟序列;其在龙眼体胚发生过程中的表达具有组织特异性,主要在球形胚和子叶形胚阶段大量积累,在松散型胚性愈伤组织、胚性愈伤组织II、不完全胚性紧实结构、心形胚和成熟胚阶段中等表达,在鱼雷形胚阶段几乎不表达,说明pre-miR398b主要在龙眼球形胚和子叶形胚阶段起主要作用。     

龙眼14-3-3基因及其启动子的克隆以及在体胚发生过程中的表达分析

分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织14-3-3基因,并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因的cDNA全长序列和DNA序列,采用TAIL-PCR法,获得龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因的启动子DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达。结果表明:经克隆得到龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因786 bp的cDNA全长序列(GenBank检索号为GU573765),该cDNA开放阅读框推定的氨基酸序列(含261个氨基酸)与其它植物14-3-3具有较高同源性;该基因的DNA序列(GenBank检索号为GU573766)长为1 859 bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因的启动子DNA序列(GenBank检索号为GU573766)长为910 bp;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,其中在松散型胚性愈伤组织阶段和心形胚及鱼雷形胚阶段呈现高表达,整个变化趋势呈"倒S"状。     

龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-4的克隆与表达分析

以龙眼（Dimocarpus longan Lour.）胚性培养物为材料,采用简并引物结合RACE方法分离得到龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-4的cDNA全长序列,全长为1 061 bp,由735个核苷酸组成的开放阅读框,编码244个氨基酸（GenBank登录号为GQ443758）。采用生物信息学方法分析,发现该基因推导的蛋白分子量为28 576 ku,pI为9.96;该蛋白为60S Ribosomal protein L30蛋白质家族成员中的L7蛋白,是一个具有核糖体蛋白L30信号位点和1个典型的Ribosomal L30 like superfamily组件,无典型信号肽结构,无跨膜螺旋的亲水性蛋白;α螺旋是该蛋白最大量的结构元件,散布于整个蛋白质中。实时荧光定量PCR分析结果显示,DlUP-4基因在龙眼体胚发生过程中均有表达,其表达水平的趋势呈“M”形,其中2个高峰出现在不完全胚性紧实结构阶段和鱼雷形胚阶段,而球形胚阶段最低。该研究结果对DlUP-4基因在龙眼体胚发生过程中的作用有了一个初步的认识,其在龙眼体胚发生过程中,在调控体胚发生的启动、细胞的极化、细胞的增殖等方面可能有重要的功能,这为进一步研究该基因在龙眼体胚发生过程中的功能奠定了基础。     

龙眼体胚发生过程中两个乙烯受体基因的定量表达分析

以龙眼体细胞胚胎发生8个不同发育阶段同步化胚性培养物为材料,采用荧光定量PCR方法,分析两个乙烯受体基因(DL-ETR1和DL-ERS1)的mRNA动态变化水平。试验结果表明:DL-ETR1表达量整体的变化趋势呈近似"W"状,松散型的胚性愈伤组织(Stage 1)的表达量最高,心形胚(Stage 6)阶段的表达量最低;龙眼体胚发生过程的8个阶段均有DL-ERS1基因的表达,子叶形胚(Stage 8)的表达量最高,其它7个阶段的表达量都很低,鱼雷形胚(Stage 7)的表达量极低,几乎不表达。DL-ETR1与DL-ERS1有着不同时期的表达模式,并且可能起到结合乙烯,调节龙眼体胚对乙烯敏感性的综合作用。     

Cloning of the Gene Encoding a Unknown Protein DlUP-4 Related to Somatic Embryogenesis from Embryogenic Cultures and Its Quantitative Expression during Somatic Embryogenesis in Longan(Dimocarpus longan Lour.)

以龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性培养物为材料,采用简并引物结合RACE方法分离得到龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-4的cDNA全长序列,全长为1061 bp,由735个核苷酸组成的开放阅读框,编码244个氨基酸(GenBank登录号为GQ443758).采用生物信息学方法分析,发现该基因推导的蛋白分子量为28 576ku,pI 为9.96;该蛋白为60S Ribosomal protein L30蛋白质家族成员中的L7蛋白,是一个具有核糖体蛋白L30信号位点和1个典型的Ribosomal L30 like superfamily组件,无典型信号肽结构,无跨膜螺旋的亲水性蛋白;α螺旋是该蛋白最大量的结构元件,散布于整个蛋白质中.实时荧光定量PCR分析结果显示,DlUP-4基因在龙眼体胚发生过程中均有表达,其表达水平的趋势呈“M”形,其中2个高峰出现在不完全胚性紧实结构阶段和鱼雷形胚阶段,而球形胚阶段最低.该研究结果对DlUP-4基因在龙眼体胚发生过程中的作用有了一个初步的认识,其在龙眼体胚发生过程中,在调控体胚发生的启动、细胞的极化、细胞的增殖等方面可能有重要的功能,这为进一步研究该基因在龙眼体胚发生过程中的功能奠定了基础.     

龙眼GPX基因的克隆、原核表达及其在体胚发生过程中的表达分析

采用RT-PCR 与RACE相结合的方法,从龙眼胚性愈伤组织中克隆了长947 bp含有完整开放阅读框的龙眼DlGPX cDNA序列（GenBank登录号为EU364813）和长度为1 736 bp的DNA序列（GenBank登录号为EU680970）。其编码1个含有168个氨基酸的蛋白质。DlGPX基因中含有5个内含子,均符合真核生物内含子通用的GT-AG 法则。生物信息学分析显示：该蛋白为亲水的酸性蛋白质,定位于叶绿体;与其他植物的GPX有较高的同源性。将该基因构建成原核表达载体,经IPTG诱导表达了１个分子量约为23 ku的蛋白。利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术研究该基因在龙眼体胚发生发育过程中的表达情况,结果显示,从松散型胚性愈伤组织到不完全胚性紧实球形结构阶段,DlGPX mRNA的转录水平逐渐升高,在胚性紧实球形结构阶段降到最低水平,子叶形胚阶段又上升到与不完全胚性紧实球形结构阶段相当的水平。     

龙眼体细胞胚胎发生研究进展

龙眼体胚发生系统是研究木本植物胚胎发生的优良体系,为研究龙眼体胚发生的分子调控机制和龙眼分子育种奠定基础。本文就龙眼胚性愈伤组织诱导与离体保存、高频体胚发生与植株再生、体胚同步化调控与组织形态学观察,体胚发生过程生理生化变化与代谢物积累、蛋白质组和全转录组测序分析、DNA甲基化研究,体胚发生相关基因克隆、全基因组鉴定及其表达模式与功能,以及遗传转化等相关研究进行综述,并对其研究前景进行展望。     

橡胶树体胚遗传转化中早代转化胚状体的PCR鉴定

橡胶树体胚遗传转化体系已成功建立,但抗性胚状体的循环增殖可获得大量抗性胚状体的同时,其后期的继代工作繁重.本文对橡胶树基因组DNA的CTAB提取方法进行了优化,同时筛选出了适合PCR检测的胚块重量.文中建立的胚块DNA的CTAB提取方法及筛选出的1～3mg重的胚块提取的DNA量均可满足早代胚状体PCR分析鉴定,且PCR鉴定结果与胚块的GUS染色结果吻合.该方法可用于橡胶树体胚遗传转化抗性胚状体早代筛选.     

荔枝体细胞胚性培养物的DNA提取方法和RAPD分析

采用补加PVP的SDS法,提取得到高质量的荔枝(Litchi chinensis Sonn)胚性培养物基因组DNA。对荔枝胚性培养物的RAPD分析结果表明:荔枝胚性和非胚性愈伤组织、玻璃化胚和白色胚、不同染色体数目的细胞系类型之间在DNA分子标记上存在差异,证实荔枝胚性愈伤组织继代及再分化过程中存在遗传物质的变异。     

荔枝"妃子笑"品种花药培养及其体胚发生

以荔枝(LitchichinesisSonn.)品种“妃子笑”为试材,研究其花药离体培养及植株再生的影响因素。结果表明,荔枝花药在MS 2,4-D2mg/L NAA0.2mg/L以及含50g/L蔗糖的培养基上诱导胚性愈伤组织效果较好,把胚性愈伤组织转移到MS BA1mg/L NAA0.5mg/L,谷氨酰胺500mg/L,蔗糖50g/L分化培养基上培养1个月后,体胚大量萌发,再将成熟体胚转移到附加500mg/L谷氨酰胺的MS无激素培养基上,培养1￣2个月后,能再生成完整植株。     

荔枝胚性悬浮培养物的建立,保持和优化原生质体分离的研究

将松散颗粒状的荔枝胚性愈伤组织转入液体培养基,２－３周后即可建立起优质的悬浮培养物,长时间悬浮培养后,荔权胚性悬浮培养物的生长势和分化能力下降,但液体培养基＋固体培养基交替培养可使其保持稳定良好的状态。材料来源,继代时间,酶液浓度,酶液渗透压和高渗预处理对胚性悬浮培养物的原生质体分离均有明显影响。     

香蕉胚性细胞悬浮培养方法的改进

针对香蕉胚性悬浮细胞培养过程中存在的胚性愈伤组织的诱导率低、周期过长、胚性易丢失等问题, 以“苹果蕉”及“威廉斯”香蕉的未成熟雄花为试验材料, 对香蕉胚性愈伤组织的诱导、 悬浮培养的理化条件进行改进。 结果表明： （1）光照条件较暗培养更有利于诱导理想的香蕉胚性愈伤组织; （2）M1培养基中加入酪蛋白和脯氨酸有利于胚性愈伤组织的诱导; （3）用微孔板代替三角瓶悬浮培养, 有利于悬浮细胞分裂增殖, 而且可减少污染的可能。     

龙眼体细胞胚胎发生过程中的内源激素变化

采用HPLC法测定了龙眼“红核子”品种胚性愈伤组织胚胎发生过程中各个不同发育阶段的内源激素含量变化。结果表明,龙眼胚性愈伤组织中内源激素含量比非胚性愈伤组织高;除GA3外,体胚发生过程中内源激素变化趋势大致呈“M”状:胚性愈伤组织Ⅱ和球形胚为变化的2个明显转折点;内源激素的变化先于形态学的变化。      

剑麻核酸的高效提取及应用

针对剑麻组织中多糖、多酚和次生物质含量高的特点,对其总RNA和基因组DNA提取进行研究。比较了改良SDS法、改良CTAB法提取总RNA和SDS法、CTAB法提取基因组DNA的效果,结果表明：改良CTAB法提取总RNA效果较佳,所得RNA OD260／OD280高于1．8,OD260／OD230大于2．0,而CTAB法提取基因组DNA纯度和完整性较好。基于RNA和DNA水平,分别对剑麻的苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）RT—PCR和RAPD反应体系进行优化,均得到理想条带。此方法提取剑麻的核酸可运用于后续分子生物学研究,为其它材料核酸的分离提供参考依据。     

一种适于PCR扩增的荞麦DNA大量提取及纯化方法

为满足对大批量材料进行分子标记检测的需要,以荞麦叶片为材料,针对荞麦叶片中黄酮含量高,提取荞麦基因组DNA时采用改良的CTAB方法,该方法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳和检测,获得的DNA条带较亮、无RNA、无拖尾现象;经分光光度计检测获得数据证明酚类、蛋白质较少。利用ISSR引物对提取的荞麦基因组DNA进行PCR检测,能获得清晰稳定的条带,说明该方法提取的荞麦基因组DNA能满足PCR反应的需要。     

巴西橡胶悬浮细胞培养胚胎发生与植株再生

研究结果表明,把２％的甘油加入到悬浮培养基中,能提高胚胎发生的频率;在悬浮培养基和固体诱导培养基中分别加入浓度为１．０ｍｇ／Ｌ和０．２ｍｇ／Ｌ的２,４-Ｄ能促进胚胎的发生;在固体培养基中添加ＡＢＡ有利于正常胚状体的形成;高浓度的谷氨酰胺对胚状体成苗培养有明显的促进作用。     

蝴蝶兰叶片体细胞胚胎发生发育及其分化成苗的研究

蝴蝶兰幼叶离体培养直接诱导体细胞胚胎的发生并进一步发育成原球茎和分化成苗。体细胞胚胎发生起源于上表皮细胞或上表皮下方的叶肉细胞,为单细胞起源。单细胞原胚分裂形成多细胞原胚,历经球形胚、梨形胚、心形胚和子叶胚的发育过程,最终成为较大颗粒状的原球茎。较高浓度的苄基腺嘌呤(6-BA)和腺嘌呤硫酸盐(AdSO4)配合使用能有效诱导体细胞胚胎的发生,最高诱导率可达40%。适当降低6-BA和AdSO4浓度有利于原球茎分化成苗,但两者浓度过低苗的生长发育会受到影响。