猪水肿毒素A亚基基因表达产物的生物学特性及抗体ELISA检测方法研究

通过TMpred生物学软件分析猪水肿毒素(SLT-IIe) A亚基蛋白质结构并设计引物、构建表达质粒使基因片段获得可溶性表达。SDS-PAGE和Western-blotting分析表明，表达产物具有可溶性从而主要存在于裂解上清液，易于纯化且具有良好免疫学活性。生物学毒性试验表明该可溶性蛋白不能致死小白鼠，也不具有Vero细胞毒性。体外细胞毒性中和试验表明表达产物的兔抗血清能高效中和SLT-IIe（中和度90.4℅）。在小鼠免疫保护力试验中，表达产物作为免疫原不能提供任何保护力。以表达产物为抗原建立的检测SLT-IIe抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，可用于临床猪水肿病的诊断。     

金华猪胎儿成纤维细胞系的建立与生物学特性分析

建立并保存家畜的成纤维细胞在保护畜禽种质资源研究中发挥着重要作用。本研究以40日龄金华猪胚胎为实验材料,采用组织贴壁法建立了金华猪胎儿成纤维细胞系,并对所建细胞系进行生物学特性研究。结果表明,原代细胞生长迅速,贴壁后2~3d可长满培养瓶,获得的成纤维细胞生长态势良好;细胞生长曲线为典型的S形,细胞群体倍增时间(population doubling time,PDT)约为36h;细胞冻存前、复苏后的活率分别为95.2%和92.8%;细胞中期染色体二倍体(2n=38)占主体约为91%,达到了建立成纤维细胞系的要求;苹果酸脱氢同工酶(malic dehydrogenase,MDH)和乳酸脱氢同工酶(lactic dehydrogenase,LDH)电泳结果表明,本细胞系没有被其他细胞污染,细胞纯度较高;细菌、真菌和支原体三类微生物检测结果均为阴性,细胞没有受到微生物的污染;15代细胞的凋亡率为2.0%,细胞没有大规模的凋亡现象发生;当阳离子脂质体(Lipofectamine2000)剂量为0.3μL、荧光蛋白报告质粒(pEGFP-N3)为0.5μg时转染成纤维细胞的效率最高,可达32.4%。细胞系各项指标均达到美国典型培养中心(American Type CultureCollection,ATCC)标准。金华猪胎儿成纤维细胞系的成功建立使金华猪种质资源在细胞水平得到保存,并可为胚胎克隆以及转基因等研究提供必要的实验材料;也可以为以后其他种质资源在细胞水平上的保存提供理论与技术支持。     

大肠杆菌猪水肿毒素B亚单位基因的克隆与鉴定

根据已知大肠杆菌志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体Ｂ亚单位（ＳＬＴ－ＩＩｖＢ）基因序列,设计并合成３条２对引物,以大肠杆菌Ｏ１３８基因组为模板,通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）分别扩增出２０４ ｂｐ的基因序列及包含一段信号肽的２６１ ｂｐ基因序列。将这两段ＤＮＡ分别克隆进表达性载体质粒ＰＹＡ３３３４的ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨⅠ位点之间,经地高辛标记探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和酶切分析鉴定,并对两条扩增片段进行序列     

检测多杀性巴氏杆菌毒素抗体的单抗竞争ELISA方法的建立

本研究以纯化的多杀性巴氏杆菌毒素基因片段的原核表达产物作为抗原免疫小鼠制备单抗,并利用表达蛋白和多杀性巴氏杆菌毒素单抗酶结合物建立了竞争ELISA方法检测多杀性巴氏杆菌毒素抗体。经过研究确定抗原包被浓度为223ng／mL,待检血清最佳稀释度为1：2,酶标单抗工作浓度为1：3200,血清抑制率大于50%为阳性。应用单抗竞争ELISA和细胞毒性中和试验同时对82份血清进行猪多杀性巴氏杆菌毒素抗体检测,竞争ELISA的检出率为40.2％,细胞毒性中和试验检出率为36.6％,两者符合率达91.5％。试验结果表明,该ELISA方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性好,操作简便。本方法的建立在实验室诊断的标准化、猪群萎缩性鼻炎疫苗免疫效果的评价及流行病学调查方面具有应用价值。     

副猪嗜血杆菌CDT毒素的生物学功能分析

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是一种常见的猪(Susscrofa domestica)致病菌,其细胞致死性膨胀毒素(cytolethal distending toxin,CDT)被认为是一种重要的毒力因子,为进一步明确CDT的一些生物学及免疫学特性,本研究经体外组装获得了高纯度的CDT三聚体完整毒素,研究三聚体蛋白对Marc145及仔猪外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBLC)的毒性作用,明确CDT三个亚基的特异性抗体对其细胞毒性的阻断作用.原核表达的3个CDT亚基经过共折叠形成了稳定的三聚体蛋白,能诱导Marc 145细胞产生典型的细胞病变.CdtB及CdtC的兔抗血清对CDT完整毒素具有中和作用,且CdtC的兔抗血清可以更有效地阻断CDT的细胞毒性作用,最大中和效价为1:16,而CdtA亚基的兔抗血清无中和作用.CDT可以抑制丝裂原活化的仔猪PBLC增殖作用.致病菌株及非致病菌株分泌蛋白中CDT的滴度一致,均为l:512.本研究结果表明,副猪嗜血杆菌CDT具有明显的免疫抑制作用,可能对于该菌在宿主体内定殖以及引起宿主系统感染至关重要,但并非造成不同菌株致病力显著差异的原因.本研究为揭示副猪嗜血杆菌的致病机理提供了重要信息.     

羊草的生物学特性及栽培技术研究

羊草是我国东北、华北、西北等干旱草原地区优良的多年生野生牧草。在生产实践中要想提高产量、质量必须熟知其生物学特性、栽培技术及羊草草场的更新复壮。     

红脂大小蠹生物学特性及防治方法

红脂大小蠹在吕梁地区一年发生两代，主要以老熟幼虫和成虫在油松根部越冬。也有以蛹越冬现象。该虫主要危害油松主干和根部，另外还发现危害华北落叶松，严重影响林木生长，并导致树木成片死亡。防治上可采用清理林地、铒木诱杀、代桩诱虫、挖树根、人工诱捕、生物防治、化学防治等方法来降低虫口密度。     

羊草的生物学特性及栽培技术研究

羊草是我国东北、华北、西北等干旱草原地区优良的多年生野生牧草。在生产实践中要想提高产量、质量必须熟知其生物学特性、栽培技术及羊草草场的更新复壮。     

柱花草炭疽病菌的鉴定及生物学特性研究

对柱花草炭疽病菌的鉴定及生物学特性测定结果表明：柱花草炭疽病菌为盘长孢状刺盘孢菌[Colletotrichumgloeosporioides（Penz）Sacc]．病菌生长温度15～36℃;适宜生长温度25～30℃;分生孢子萌发的温度6～40℃,最适萌发温度为28℃;分生孢子在饱和湿度下萌发率为83．1％,在饱和湿度加水滴中达87．9％;分生孢子的致死温度为49℃10min;病菌生长的pH值是2．5～14．0,最适pH值为6．4～7．2;病菌对碳源的利用较氮源好。     

基于M蛋白检测犬瘟热抗体ELISA方法的建立

犬瘟热病毒(Canine disremper virus,CDV)是导致犬科等多种属动物发热、腹泻、幼仔死亡等症状的传染病病原体,建立针对CDV的快速灵敏的诊断方法对于该病的防治具有重要意义。本研究利用RT-PCR方法扩增得到CDV-M基因,构建原核重组表达载体p ET-28(a)-CDV-M,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现了该蛋白的表达和纯化,Western blot验证重组蛋白的抗原性,用纯化的重组蛋白his-CDV-M作为抗原包被酶标板,ELISA方阵实验确定该重组蛋白的包被浓度,建立了检测临床犬血清样品的CDV-M蛋白抗体的间接ELISA方法,比较本实验方法与其他试剂盒之间的特异性和灵敏性。结果表明重组蛋白his-CDVM得到较好表达,纯化后蛋白浓度为2.840 mg/m L。Western blot结果表明重组抗原能与犬瘟热阳性血清进行反应。方阵实验确定抗原最佳工作浓度为8.88μg/m L,抗体最佳稀释度为1∶160,应用本方法检测223份犬血清样品,与进口CDV诊断试剂盒检测结果符合率为96%。本研究建立的基于M蛋白的犬瘟热病毒抗体检测方法具有较高的特异性和灵敏性,为犬瘟热病毒的诊断及M蛋白的功能研究提供了工具。     

北方地区大豆根瘤菌的生物学特性

对北方地区大豆根瘤菌的生物学特性进行了较为系统的研究,结果表明,黑、辽地区分离、纯化的17株根瘤菌均具有典型的根瘤菌的个体形态和菌落特征,生理生化指标接近,可与辽豆15共生结瘤,分为快生菌和慢生菌。所有根瘤菌均可不同程度地利用供试的5种碳源。耐酸碱度、耐盐性及温度敏感实验表明,菌株HS3可在pH6.0~9.0生长,菌株HH4可耐受1.5%氯化钠,菌株HH4,HH2可在13℃~39℃生长。     

B族黄曲霉毒素抗原合成设计及特异性、广谱性抗体制备与特性分析

为制备B族黄曲霉毒素(BGAFs)特异性强、广谱性好的抗体,本研究根据黄曲霉毒素B₁(AFB₁)的分子结构和活性位点,采用肟化活泼酯法(OAE)、氨甲基化法(MOA)、混合酸酐法(MA)、半缩醛法(SA)、环氧化物法(EP)和烯醇醚衍生物法(EED)6种方法合成BGAFs人工抗原AFB₁-BSA,并通过UV和SDS-PAGE进行鉴定;采用AFB₁-BSA免疫新西兰白兔制备多克隆抗体(AFB₁ pAb),间接ELISA检测AFB₁ pAb效价,间接竞争ELISA(icELISA)分析其敏感性,交叉反应试验(CR)分析其特异性和广谱性。结果表明,AFB₁-BSA合成成功,在BGAFs抗原合成的6种方法中OAE效果最好,AFB₁与BSA的分子结合比为8.46∶1;AFB₁ pAb的间接ELISA效价为1∶(1.28×10⁴),IC₅₀为10.32 μg·L^-1,与AFB₂、AFG₁、AFG₂、AFM₁、AFM₂的CR分别为75.21%、44.13%、14.72%、16.36%、1.44%。本研究制备出了高效价、敏感、特异、广谱的AFB₁ pAb,为BGAFs免疫检测方法的建立奠定了物质和技术基础。     

猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立及初步应用

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)属单股DNA的圆环病毒科.根据致病性及基因组序列,PCV可分两种血清型,即PCV-1和PCV-2.     

西瓜枯萎病菌生物学特性测定及防治试验

对西瓜枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｉｕｍｆ．ｓｐ．ｎｉｖｅｕｍ）的生物学特性测定结果表明：病菌生长温度范围１０～３５℃，适宜生长温度２５～２８℃；分生孢子在饱和相对湿度下萌发率为７２．６％，在水滴中达８５．２％；分生孢子的致死温度为５５℃１０ｍｉｎ；病菌生长的ｐＨ值范围在２．３８～１１．４５，最适ｐＨ值为６．６５～９．６９。室内药效测定结果表明：７０％代森锰锌３００倍，４０％灭病威３００倍和５００倍，２５％多菌灵３００倍和抗枯灵５００倍对枯萎病菌菌丝生长有明显的抑制作用。田间防治以嫁接苗的防治效果最好，达９１．２％；其次为１５％粉锈宁１０００倍和５０％ＤＴ６００倍，防效分别为６８．４７％和６５．０５％。     

猪蓝耳病病毒RT-LAMP快速可视化检测方法的建立

为建立能快速检测猪蓝耳病病毒（PRRSV）的检测方法,本研究根据基因库中PRRSV非结构蛋白NSP2基因的保守序列,设计了一套特异性环介导等温扩增（RT-LAMP）引物,建立了PRRSV的RT-LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10 copies RNA,高于常规PCR方法 10倍;全部反应可以在50 min内完成;可通过肉眼观察钙黄绿素（calcein）颜色变化直接判定结果;对其它常见病原体的检测结果均为阴性,同时应用实时浊度仪对反应体系浊度及浊度的变化速率进行实时测量,结果相一致。结果表明建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于PRRSV感染的快速检测。     

转基因植物释放Bt毒素的土壤环境行为与生物学效应

Bt(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白基因是植物抗虫基因工程中应用最广泛的基因,随着大批转Bt基因作物的商品化,Bt毒素对土壤生态系统的影响已引起了人们的高度关注。本文对转基因植物释放Bt毒素的土壤环境行为与生物效应进行了综述,包括Bt毒素蛋白进入土壤的途径、在土壤中的运动、与土壤颗粒的结合与存留及其对土壤生物和土壤酶的影响。     

安徽省大豆疫病病原鉴定及生物学特性研究

自安徽蒙城大豆疫病病株上分离得到2个疫霉菌株,对其培养性状、形态特征、生理特性等方面进行了鉴定研究。结果表明,2个菌株均为同宗配合的,雄器绝大多数侧生,偶见围生;孢子囊无乳突,不具脱落性,内层出;最高生长温度35°C,最低生长温度高于7°C,对孔雀绿敏感;对大豆具有致病性。根据研究结果,参照主要疫霉分类检索表,将上述菌株鉴定为大雄疫霉大豆专化型(P hy tophthora m eg asp erm af.sp.g ly cinea)。据此初步认为大雄疫霉大豆专化型是引致安徽蒙城大豆疫病的病原菌。     

水分胁迫对冬小麦光合及生物学特性的影响

利用阜康绿洲农田的田间灌水试验，研究了不同水分胁迫程度、不同水分胁迫时期对冬小麦光合，茎秆生长、地上和地下干物质累积以及籽粒产量的影响。结果表明；随着水分胁迫程度的加剧。冬小麦光合作用、株高、干物质累积、根系生长以及籽粒产量受到的抑制作用逐渐增强；灌水量为田间持水量40％的处理在成熟期时根干重要大于其它处理。是由于干旱胁迫促进了新生根的生长．从而可使根系充分吸收中下层土壤贮水。这是减少灌水次数和提高水分利用效率的一个有效途径，冬小麦灌浆期受到重度的水分胁迫，籽粒产量明显下降．而拔节期遭受轻度的水分胁迫在恢复灌水后产量反而要高于其它处理。     

外来入侵植物银胶菊的生物学特性

采用田间观察和室内盆栽试验相结合的方法,对银胶菊（Parthenium hysterophorus L.）的物候期、生育习性、不同条件下种子萌发情况等主要生物学特性进行观察研究。结果表明：银胶菊为一年生有害杂草,以种子进行有性繁殖,其生长历期约为170d;3月中旬至9月下旬均有出苗,出苗高峰期为4月上旬和8月下旬,其出苗率分别为21．65％和11．9％;植株分枝期在5月中旬至7月初,5月下旬至8月上旬为开花期,7月中旬至8月下旬为结果盛期;单株瘦果量为7500～10000粒,千粒重为0．74～0．76g。瘦果在成熟后约有3个月的休眠期,种子萌发的适宜温度为15～30℃。种子出苗率与瘦果土埋深度有密切关系,瘦果处于土表时,种子出苗率最高,瘦果土埋深度超过1．5m时,种子不能出苗。     

水牛原始生殖细胞(PGCs)的分离培养及生物学特性的研究

以水牛胎儿为材料,从生殖腺中分离培养出牛原始生殖细胞,并对水牛原始生殖细胞的分离与克隆的影响因素进行了探讨。结果发现:(1)分离培养出的原生殖细胞(PGC s)呈集落状生长,细胞堆积密集,细胞之间界限不清,细胞与周围的成纤维细胞界限明显;未分化的细胞表达碱性磷酸酶(AKP)以及O ct-4转录因子;(2)收集妊娠29~100 d牛胎儿28例,从生殖嵴(腺)或类似物中分离克隆水牛PGC s,23例出现PGC s细胞集落。其中胎龄小于45 d(<3.0 cm)和45~55 d(3.0~5.0 cm)各7例,全部出现PGC s细胞集落;55~70 d(5.0~9.0 cm)9例,有7例出现PGC s细胞集落,大于70 d的5例,有2例出现出现PGC s细胞集落。结果表明,水牛原生殖细胞具有多能性特性,胎龄小于55 d的水牛胎儿易于分离培养形成PGC s集落。