稻瘟病菌细菌人工染色体（BAC）基因组文库的构建

 稻瘟病菌是一种重要的植物病原菌,同时又是研究植物和病原物之间相互关系的一个重要试验系统。实验通过采用95-23-4a稻瘟病菌株经提取纯化得到该稻瘟病菌的细胞核基因组总DNA,用限制性内切酶部分酶解后,与经末端去磷酸化处理过的pCUGIBAC1质粒载体按一定摩尔比例相互连接,通过转化E.coli DH10B感受态细胞进而通过蓝白斑筛选挑取白色克隆从而构建了95-23-4a稻瘟病菌株的细菌人工染色体（BAC）基因组文库。通过进行酶切检测及Southern杂交分析后确定所构建的BAC文库平均插入片段29.1 kb,该文库覆盖7.4倍基因组,此基因组文库的构建为该菌致病相关基因的克隆奠定了基础。     

关中奶山羊BAC文库构建条件研究

BAC(bacterialartificialchromosome,细菌人工染色体)是一种新发展起来的构建高等生物基因组文库的重要方法。由于关中奶山羊产奶性能好,成为制备乳腺生物反应器的理想动物之一,故对关中奶山羊BAC文库的构建条件进行了研究。用BamH 部分酶切关中奶山羊的基因组,用CHEF(箝位匀强电场)凝胶电泳分离大片段DNA,以电透析法回收DNA后,与酶切脱磷的pBeloBAC11载体连接,然后电激转化感受态细胞DH10β,得到了数千个阳性克隆,插入片段平均为30～40kb。在此过程中摸索了BAC载体制备、高分子量DNA制备、酶切、连接和电激转化等一系列环节对高效转化产生大片段DNA克隆的影响。     

硫藤黄链霉菌基因组表达文库的构建及筛选

为了探讨硫藤黄链霉菌中可能存在的次级代谢产物合成及调控机制,以链霉菌整合型质粒pJTU2554为载体,构建了硫藤黄链霉菌的基因组表达文库。以模式菌株变铅青链霉菌为异源表达宿主,通过生物活性筛选获得9株具有抑菌活性的异源表达突变菌株,同时通过PCR筛选获得多个含有聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的克隆子。TLC及HPLC-MS分析发现6个携带有aureothin生物合成基因簇的cosmid,通过异源表达在变铅青链霉菌中成功合成聚酮类抗生素aureothin,证实文库异源表达及筛选的有效性。     

灰红链霉菌AL7基因组文库及异源表达文库的构建

灰红链霉菌AL7对多种植物病原真菌和细菌都具有明显的抑菌活性。本研究在通用的大肠杆菌克隆宿主基础上,构建获得Dcm甲基化缺陷菌株,再引入接合转移辅助质粒pUZ8002得到菌株LP3。以LP3为宿主构建灰红链霉菌AL7的基因组粘粒文库,平均插入片段大小40kb。用高通量接合转移的方法将文库转到变铅青链霉菌TK24中,得到了异源表达文库,并从表达文库中初筛获得一些表型特异的克隆,如光秃表型、产素提前表型、产孢提前表型等。     

南瓜基因组DNA的细菌人工染色体(BAC)文库的构建

[目的]构建南瓜基因组DNA的细菌人工染色体(BAC)文库。[方法]以南瓜幼芽为材料,利用HindⅢ酶切体系,初步构建南瓜基因组DNA的BAC文库。[结果]研究成功构建了南瓜基因组DNA的BAC文库。[结论]该技术为南瓜相关基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和基因组测序等研究工作奠定了基础。     

瘤胃元基因组BAC文库研究

目前，传统的分离培养技术在瘤胃微生物的研究中仍存在一些无法逾越的障碍。元基因组文库（metagenomiclibraries）及相关技术的发展，为探讨环境中未培养微生物以及复杂的微生物间关系创立了一个新的平台。将该技术应用于瘤胃微生物研究有着广阔的前景。本文综述了元基因组文库技术在瘤胃微生物研究中的应用潜力，同时介绍了初步应用BAC文库研究瘤胃微生物工作的一些进展。     

阿维链霉菌BAC文库的构建及分析

为进一步阐明阿维菌素的生物合成路径和调控途径,提高阿维菌素的产量,采用BamHⅠ限制性内切酶酶解阿维链霉菌基因组DNA的方法,构建了阿维链霉菌的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含2 304个克隆,平均插入片段为101kb,空载率约9%,覆盖了该菌基因组的25.9倍。该文库的成功构建可以为其他微生物尤其是基因组具有磷硫酰化修饰的微生物的文库构建提供参考。     

瘤胃微生物基因组文库中BAC末端序列分析

基于前期从瘤胃微生物基因组文库中筛选的功能酶克隆菌,利用T7和pIBRP引物,测定功能酶克隆菌的BAC末端序列,并利用NCBI Blast系统对BAC末端序列进行分析.结果表明:共得到26条BAC末端序列,经Blast比对分析,与已知编码基因的匹配度低,而大部分BAC末端序列与阪崎肠杆菌和环境中的微生物匹配度高,说明瘤胃中的微生物与其它环境中的微生物具有一定的相似性,进一步丰富了对瘤胃微生物的认识.     

山羊基因组文库的构建研究

构建了山羊基因组文库,为筛选山羊乳蛋白基因,构建山羊乳蛋白基因定点整合的转基因敲入载体奠定基础。全血提取基因组DNA,Sau3AΙ部分酶切,分级分离回收15~23kb片段,将片段插入LambdaBlueSTARBamHΙvector,连接并包装后,NotI酶切鉴定。结果表明,文库滴度为3.4×106;共得到1.7×106个有效克隆,插入片断长度在15~23kb范围,成功构建了西农萨能奶山羊基因组文库。     

双元细菌人工染色体基因组文库研究进展

酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)是伴随着人类基因组计划的实施而产生的,这些大片段基因克隆载体的应用推动了分子生物学、遗传学等学科的快速发展。以农杆菌介导的直接转化植物为代表的双元细菌人工染色体(BIBAC)载体的发展,加速植物基因组的研究,成为植物基因组分析、基因功能鉴定、染色体结构与功能关系研究的重要工具。介绍了人工染色体文库的发展史,根据建库经验,着重阐述了BIBAC文库的构建、鉴定与应用。     

一种用高拷贝质粒载体制备BAC载体基本功能基因的新方法(英文)

[Objective] The aim of this study was to provide a method for solving the problems in preparing BAC vector with High-copy plasmid pUC119-Bluelox BAC.[Method] With selecting a proper single restriction site,sequences of a single copy BAC vector plasmid were inserted into proper site of High-copy plasmid pUC119 vector.[Result] The gene sequence of BAC vector lost control function of single copy number in new plasmid pUC119-BAC and was copied through High-copy form. The gene sequence of BAC vector basic function was completely cutted off through single enzyme digestion and the control function of single copy could be recovered by auto-connection.[Conclusion] The High-copy pUC119-BAC plasmid was used to copy and amplify high copy of basic function gene sequence in BAC vector,besides that it could be used to construct transfer vector of molecular cloned recombinant virus or BAC library.     

Research on the Construction of Bacterial Artificial Chromosome Vector DNA and the Potentials in Application

[Objective] The aim of this study was to provide a method for solving the problems in preparing BAC vector with High-copy plasmid pUC119-Bluelox BAG. [Method] With 8electing a proper single restriction site, sequences of a single copy BAC vector plasmid were inserted into proper site of High-copy plasmid pUC119 vector. [Result] The gene sequence of BAG vector lost control function of single copy number in new plasmid pUC119-BAC and was copied through High-copy form. The gene sequence of BAC vector basic function was completely cutted off through single enzyme digestion and the control function of single copy could be recovered by auto-connection. [ Conclusion ] The High-copy pUC119-BAC plasmid was used to copy and amplify high copy of basic function gene sequence in BAG vector, besides thai it could be used to construct transfer vector of molecular cloned recombinant virus or BAC library.     

Research on the Construction of Bacterial Artificial Chromosome Vector DNA and the Potentials in Application

[Objective] The aim of this study was to provide a method for solving the problems in preparing BAC vector with High-copy plasmid pUC119-Bluelox BAC.[Method] With selecting a proper single restriction site,sequences of a single copy BAC vector plasmid were inserted into proper site of High-copy plasmid pUC119 vector.[Result] The gene sequence of BAC vector lost control function of single copy number in new plasmid pUC119-BAC and was copied through High-copy form. The gene sequence of BAC vector basic function was completely cutted off through single enzyme digestion and the control function of single copy could be recovered by auto-connection.[Conclusion] The High-copy pUC119-BAC plasmid was used to copy and amplify high copy of basic function gene sequence in BAC vector,besides that it could be used to construct transfer vector of molecular cloned recombinant virus or BAC library.     

一种用高拷贝质粒载体制备BAC载体基本功能基因的新方法

介绍一种改进的用普通高拷贝质粒pUC119来制备细菌人工杂色体（BAC）载体基本功能基因序列的新方法及其在构建分子克隆化病毒中的应用,该方法可使BAC载体基本功能基因序列的制备更为简易、高效。     

球孢链霉菌JK-1抗菌物质的理化特性研究

[目的]明确球孢链霉菌JK-1抗菌物质的基本理化性质.[方法]以稻瘟菌为指示菌,采用菌丝生长速率法分别测定球孢链霉菌JK-1发酵滤液在不同温度、不同酸碱度、蛋白酶K处理和硫酸铵盐析之后的抑菌活性;采用硫酸铵盐析对抗菌物质进行初步提纯,并通过超滤的方法初步测定该抗菌物质的分子量大小.[结果]球孢链霉菌JK-1产生的抗菌物质在高温和蛋白酶K处理的情况下抑菌活性显著降低,在pH2 ～ 11条件下抑菌活性无显著变化,而pH≥11的强碱性条件下抑菌活性显著降低.饱和度为50％的硫酸铵即可将发酵液中的抗菌物质完全沉淀下来,超滤发现其分子量在10 ～ 30 kD.[结论]该研究结果为球孢链霉菌的田间应用及其抗菌物质的分离鉴定奠定了基础.     

细菌人工染色体文库的构建与鉴定

细菌人工染色体是继γ噬菌体、黏粒、噬菌体人工染色体、酵母人工染色体等载体系统之后发展起来的DNA载体系统,以其容量大、遗传特性稳定、嵌合体少、插入片段易回收、操作简便等优点,而被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组研究中,并发挥着前所未有的重要作用。因此本文概括性地阐述了细菌人工染色体的发展,以及利用此载体构建基因组文库的机理和程序及其鉴定方法。     

琯溪蜜柚BAC文库的构建和汁胞粒化相关基因的筛选

【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果】改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法;构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1%,叶绿体DNA的污染率不超过1%,插入片段平均大小大约120kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122bp和172bp的内含子,经同源比对发现,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85%和71%的同源性;与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76%和73%的同源性。【结论】本研究构建的BAC文库适用于琯溪蜜柚功能基因组的研究,从BAC文库筛选获得的DNA序列与汁胞粒化相关的基因有高度同源性。