侵染广东番茄的番茄褪绿病毒分子鉴定

在广东番茄上发现一种新病害,病株表现为叶片褪绿,叶脉颜色变深及叶片增厚等症状。利用番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)HSP70基因的两对特异引物对番茄病样进行RT-PCR检测,结果表明,从所采集的6份病样中均扩增到预期大小的DNA特异片段。对其中1份样品的扩增片段进行克隆与序列分析,结果表明,扩增片段包括1个长度为1 665个核苷酸的完整病毒基因,其核苷酸序列与已报道的ToCV HSP70基因有较高的同源性,表明广东番茄受到了ToCV的侵染。但ToCV广东番茄分离物的HSP70序列与国内外已报道的各分离物的同源性均低于82%,存在较大差异,其中与塞浦路斯tomato、约旦JU_20分离物的同源性最高,为81.8%。这是ToCV在广东发生的首次报道,也是该病毒HSP70基因序列存在显著差异分离物的首次发现。     

北方四省区番茄褪绿病毒的分子鉴定

2015-2016年间,在山西省、内蒙古自治区、辽宁省、吉林省采集到疑似感染番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)的番茄植株。利用扩增ToCV外壳蛋白(coat protein,CP)和类热激蛋白(heat shock protein 70homolog,HSP70h)基因片段的两对特异性引物,通过RT-PCR对疑似样品进行分子检测,得到970bp和1 864bp的特异条带,经测序、比对确定为ToCV。序列分析表明,山西晋中分离物SXJZ(KX853540)的CP核苷酸序列与河南安阳分离物HNAYHX(KP264983)相似性为99.7%,内蒙古呼和浩特分离物NMHHHT(KU204709)和辽宁大连分离物LNDL(KU204707)的CP核苷酸序列与国内已报道的山东寿光分离物SDSG(KC709510)相似性分别为99.5%和99.7%,吉林长春分离物JLCC(KU306111)的CP核苷酸序列与山东聊城分离物SDLC(KC812622)的相似性为99.8%。而HSP70h核苷酸序列的相似性分析表明,山西晋中分离物SXJZ(KX853539)与日本分离物Tochigi(AB513442)相似性为99.4%,内蒙古呼和浩特分离物NMHHHT(KU204710)、辽宁大连分离物LNDL(KU204708)和吉林长春分离物JLCC(KX880384)与山东寿光分离物SDSG(KC709510)相似性分别为99.7%、99.8%和99.7%。试验结果明确了番茄褪绿病毒已蔓延传播到我国山西、内蒙古及东北地区。     

侵染番茄的番茄褪绿病毒山东泰安分离物的分子鉴定和序列分析

2012年秋季, 在山东泰安番茄主要种植区中采集到叶片褪绿, 叶脉颜色变深的疑似番茄褪绿病毒病和番茄侵染性褪绿病毒病的番茄样品。利用番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)的特异引物 ToCV1/ToCV2和番茄侵染性褪绿病毒(Tomato infectious chlorosis virus, TICV)的特异引物TICV1/TICV2分别对样品进行扩增, 最后仅得到利用引物 ToCV1/ToCV2 扩增的101 bp 的核苷酸序列, 对该核苷酸序列克隆并测序。序列比对表明, 山东泰安地区分离物与已登录的番茄褪绿病毒(ToCV)分离物相似性都在99%以上。随后, 对山东泰安种植区ToCV番茄分离物进行外壳蛋白(CP)及热激蛋白(HSP70)序列的扩增、克隆和测序(GenBank登录号KC812620/KC812625), 经NCBI BLAST比对发现, 目的序列与番茄褪绿病毒日本番茄分离物ToCV Japan/Tochigi (GenBank登录号AB513442/AB513443)相似性最高为99%, 同属于毛型病毒属的番茄褪绿病毒, 这是首次明确山东地区番茄受到番茄褪绿病毒的侵染。     

侵染甜椒的番茄褪绿病毒的分子鉴定

番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus, ToCV）是一种由粉虱传播的RNA病毒,可以侵染番茄和辣椒等常见蔬菜,已在世界多地造成严重危害。2012年在北京市大兴区调查蔬菜病毒病时发现保护地栽培的甜椒植株表现脉间褪绿症状,且植株上烟粉虱数量多,初步推测为ToCV危害。通过提取显症样品总RNA,利用ToCV特异性引物进行反转录PCR,扩增得到463 bp的目标条带。通过测序和核苷酸序列比对分析,表明该序列与国外已报道的ToCV HSP70h（the heat shock protein 70 homolog,热激蛋白70家族）基因序列相似性为99%。这是对ToCV在我国侵染甜椒的首次报道。     

番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染对番茄褪绿病毒传播的影响

番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)是一种由烟粉虱Bemisia tabaci传播的正义单链RNA病毒,在田间常与番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)复合侵染而造成番茄生产上重大的经济损失。为了明确ToCV与TYLCV的复合侵染对烟粉虱传播ToCV所造成的影响,本文采用RT-PCR以及qRT-PCR检测了复合侵染的番茄对烟粉虱获取和传播ToCV的影响。研究表明,烟粉虱取食复合侵染的番茄后对ToCV的传播效率显著提高,仅25头烟粉虱的传毒率即可达到100%,ToCV在烟粉虱以及番茄体内的累积量均显著提高。说明这种复合侵染促进了烟粉虱对ToCV的传播,在田间应当及时防控烟粉虱,警惕病毒与烟粉虱的蔓延。     

北京地区茄子感染番茄褪绿病毒的分子鉴定

为明确北京地区茄子感染番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)的情况,于2015年3—6月收集了10份疑似感染To CV的设施茄子样品,通过PCR分子鉴定法进行检测,并进一步对扩增阳性样品To CV的CP基因采用邻接法进行了系统进化分析。结果表明,10个检测样品中有4个扩增得到约463 bp的特异条带,经测序与Gen Bank中To CV序列相似性达到99.0%以上,表明这4个样品均携带有该病毒,检出率为40%;To CV茄子分离物的CP基因序列大小为774 bp,Gen Bank登录号为KT751008,与To CV北京番茄分离物(KC311375)同源性最高,达到99.9%,确认该序列为To CV片段;系统进化树显示,To CV茄子分离物与To CV日本分离物(AB513443)处于同一分支,具有密切的亲缘关系,表明不同国家To CV分离物之间的亲缘关系与地理距离具有一定的相关性。     

警惕番茄褪绿病毒在我国的传播和危害

番茄褪绿病毒( Tomato chlorosis virus, ToCV )侵染番茄引起番茄褪绿病毒病。发病植株下部叶片黄化、脉间褪绿、边缘轻微卷曲, 叶片光合作用显著降低, 果实变小, 产量和品质明显下降。该病毒最早于1998年在美国佛罗里达州发现, 随后在世界多地陆续报道。我国首先于2004年在台湾报道, 2013年又在北京和山东发现并鉴定了该病毒, 同时在辣椒上检测到该病毒。ToCV属于长线形病毒科( Closteroviridae )毛形病毒属( Crinivirus )成员, 基因组为二分体正义单链RNA, 由粉虱传播。经初步调查和检测, ToCV在我国北京、山东、河北、天津等省市相继发生, 给当地番茄生产造成了严重危害。ToCV传播迅速, 成为我国番茄生产中又一重要病毒, 防控形势严峻。基于以上原因, 建议有关部门立即采取相应预防和防治措施, 组织开展相关研究和攻关, 控制该病毒在我国的传播和危害。     

番茄褪绿病毒侵染黄瓜的首次报道

番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)是严重危害世界经济作物的一种病毒,寄主范围广泛。田间调查发现黄瓜Cucumis sativus表现出叶片黄化、脉间褪绿的疑似番茄褪绿病毒感病症状,同时叶片背面聚集了大量烟粉虱。采用RT-PCR方法对样品叶片和烟粉虱进行检测,ToCV感染率为65%,且发病叶片上烟粉虱携带ToCV。为进一步确定黄瓜是否为番茄褪绿病毒的新寄主,室内利用农杆菌侵染性克隆接种健康黄瓜,结果显示:接种30 d的黄瓜新生叶片出现褪绿症状。采用ToCV HSP70基因的引物对田间黄瓜叶片、烟粉虱和室内黄瓜新生叶片进行RT-PCR,扩增出约450 bp的条带,在NCBI上BLAST显示与KC887999.1的同源性最高,为99%。这些数据表明黄瓜是番茄褪绿病毒的寄主。这是ToCV感染黄瓜的首次报道。     

河北省番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒复合侵染及分布

 番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) 及番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)是危害番茄的主要病毒。2016~2017年,在河北省18个番茄主产区调查番茄病毒病危害情况,采集262份植株矮化、叶片黄化、褪绿、卷曲的番茄样品,利用分子生物学技术对病原进行鉴定。结果表明:2016~2017年河北省番茄病毒病发生普遍,所检样品中TYLCV的侵染率为68.66%,其中与ToCV复合侵染率为19.5%;除栾城、滦南、乐亭、永年4地样品暂未检测到ToCV外,其他14个采样点的样品均检测到ToCV,侵染率为19.5%,且全部表现为与TYLCV复合侵染,河北省番茄主产区暂未发现ToCV单独侵染的样品。     

番茄褪绿病毒RT-PCR检测技术的优化及河南分离物的鉴定

为获得高效、灵敏和稳定的番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)RT-PCR检测体系,选取文献报道的和重新设计的共9套ToCV的RT-PCR引物,经过一系列测试和比较,筛选出了灵敏度、特异性均较高的引物组合,并对反应条件、参数进行了优化,确定了最优反应条件。应用优化的ToCV RT-PCR检测体系对从河南设施蔬菜生产区采集的疑似感病番茄样品进行检测,扩增产物测序后经BLAST比对发现,河南分离物的CP和HSP70基因序列与GenBank上注册的ToCV典型分离物序列的相似性均达94%以上,通过对ToCV病毒粒子的电镜观察而进一步确定ToCV已在河南侵染设施番茄。     

Tomato infectious chlorosis virus causes leaf yellowing and reddening of tomato in Italy

Since autumn 2000, severe and widespread chlorosis, sometimes associated with redness, has been observed in greenhouse tomatoes in different regions of Italy. A total of 104 samples were analyzed for tomato infectious chlorosis virus (TICV), by a one-step RT-PCR procedure. In some areas of central Italy and Sardinia, the symptom was consistently correlated with the presence of TICV. The RT-PCR procedure enabled rapid and reliable detection of TICV from field samples. Sequence analysis of the amplified 501-bp fragment, part of the HSP70 coding region, revealed an identity of 99% with the TICV sequence in the GenBank database. A digoxigenin-labeled DNA probe was also produced and successfully tested in dot blot assays. This is the first report of TICV causing epidemics in Europe.     

一种基于RPA的番茄褪绿病毒检测方法

番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)引起番茄褪绿病毒病,给番茄生产造成严重危害。开发快速准确的检测方法对该病害的防控具有重要意义。利用番茄褪绿病毒外壳蛋白(CP)基因序列,设计特异性引物,建立了ToCV的重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)检测方法,同时分析了该方法的灵敏度和特异性。结果表明,建立的ToCV-RPA方法在38℃恒温下40 min可从ToCV阳性的番茄样品中扩增出246 bp的特异性条带。扩增时间短,对设备要求低,且与番茄其他病毒无交叉反应,特异性好,灵敏度可达到PCR方法的10倍,适用于ToCV的快速检测。