水稻核糖体蛋白（OsRPL14）基因的克隆及表达分析

通过荧光差异显示（fluorescent differential display,FDD）以及RT-PCR技术,得到一个水稻核糖体蛋白基因。该基因的cDNA全长为565bp,编码一个具有134个氨基酸残基的多肽,推测分子量是15.4kD。与其他植物中核糖体蛋白L14的相似性为82.84%～88.06%,命名该基因为OsRPL14。在低温（8℃）及干旱条件处理下,该基因表达量在根和茎中都有比较明显的增加趋势。推测该基因在逆境反应中起着重要作用。     

青稞核糖体蛋白基因HbRPL19的克隆、序列分析及原核表达

【目的】克隆青稞核糖体蛋白基因HbRPL19,分析其序列特征并在大肠杆菌中诱导目的蛋白,为后续的研究奠定基础。【方法】根据鉴定得到的青稞HbRPL19的序列设计了引物,从青稞叶片的c DNA中扩增得到目的片段,并对目的基因序列进行了测序鉴定和序列分析,同时构建了原核表达载体p ET28a-RPL19,转化入大肠杆菌BL21(DE3)后利用IPTG诱导外源蛋白质表达并检测。【结果】成功扩增出了青稞核糖体蛋白基因HbRPL19的CDS全长序列,大小为654 bp。根据生物信息学分析的结果,HbRPL19编码的蛋白质含有217个氨基酸,相对分子质量为24.47 KD,理论等电点(p I)为10.42,总平均亲水性(GRAVY)为-0.353,不稳定系数为53.46,存在典型的SH3-like结构域和核糖体蛋白L19结构域。系统进化分析表明,HbRPL19与小麦和山羊草的RPL19具有较近的亲缘关系。蛋白表达结果显示,重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。【结论】获得了青稞抗寒相关基因HbRPL19的序列和蛋白。     

花生ABI3基因的克隆、序列分析及表达载体构建

脱落酸(ABA)作为植物体内的一种重要激素,参与植物多个生长发育过程。ABI3是ABA信号转导途径中的关键基因。本研究采用RT-PCR技术从花生成熟种子中克隆到ABI3的同源基因AhABI3。预测该基因开放阅读框为2313 bp,编码770个氨基酸。同源比较发现Ah ABI3与拟南芥、鹰嘴豆等的ABI3具有较高的相似性;进化分析表明AhABI3与鹰嘴豆ABI3亲缘关系最近。本研究还成功构建了AhABI3的过量表达载体pCambia2300EC-Ah ABI3,为进一步研究其功能奠定了基础。     

DREB 2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

研究提取盐处理的拟南芥植株叶片总RNA,用DREB2A基因特异引物通过RT-PCR扩增出1050bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的DREB2A基因序列同源性达100%。进一步将DREB2A基因分别克隆至植物表达载体卡盒pCCE12和pCC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DREB2A基因植物表达载体pCDRE12和pCDR29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导的DREB2A基因对植物的遗传转化奠定基础。     

大豆铁结合蛋白基因cDNA的克隆、序列分析和表达载体的构建

根据已报道的植物铁结合蛋白基因的保守序列设计引物，用RT－PCR方法，成功地从大豆总RNA中扩增出一大小为0.771kb的cDNA片断。将该片段克隆到pUCm-T载体上，测序和序列的同源怀分析表明该片断与Proudhon等（1996）报道的大豆铁结合蛋白基因的氨基酸序列同源性达95％。利用pUCm-T和pBI121载体上共同的XbaI和SacI双酶切位点，构建了克隆片段的植物表达载体pSFKna。该载体含CaMV35S启动子、NOS终止子和NPT－Ⅱ基因，在遗传转化中可用基因枪导入受体，并通过卡那霉素抗性筛选转化子。     

籼稻GAD基因的克隆、序列分析及其植物表达载体构建

[目的]克隆籼稻谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的全长cDNA,并进行序列分析和植物表达载体构建,为改良水稻的营养保健品质奠定基础.[方法]根据已知植物GAD基因的保守区域设计引物,以高GABA籼稻品系“新-9-4”的胚芽为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆GAD基因的全长cDNA;扩增其编码序列,构建双T-DNA植物表达载体.[结果]扩增获得长1962 bp的籼稻GAD基因全长cDNA(OsiGAD),包含1479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸.OsiGAD与已报道的水稻GAD基因OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3的核苷酸序列同源性分别为67.1%、69.4%、98.3%,推导氨基酸序列的同源性分别为77.6%、70.1%、100.0%.OsiGAD蛋白序列具有磷酸吡哆醛结合位点和与钙调蛋白结合的C端延伸区域;构建了其具有水稻胚乳特异表达特性的双T-DNA植物高效表达载体pCDMAR-OsiGAD-hpt,选择标记基因和OsiGAD-因分别位于此载体的两个不同T-DNA区.[结论]克隆获得的籼稻GAD基因OsiGAD长1962 bp,并成功构建了其双T-DNA植物高效表达载体.     

野桑蚕核糖体蛋白L21基因的克隆及序列分析

[目的]克隆野桑蚕(Bombyx mandaina)核糖体蛋白L21(RPL21)基因并进行半定量分析,为研究RPL21基因在昆虫体内的生物学功能提供参考.[方法]采用RT-PCR克隆野桑蚕RPL21基因序列,并采用半定量PCR分析该基因在野桑蚕4龄幼虫不同组织中的表达情况.[结果]扩增获得的野桑蚕RPL21基因序列全长为586 bp,其包含一个完整的开放阅读框(ORF),长度为480 bp,编码159个氨基酸;预测蛋白的分子量和等电点分别为18 kDa和11.01.序列比对结果表明,野桑蚕与其他12个物种的RPL21基因的相似性介于55.5%~91.6%,其中与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)RPL21的相似性最低,与家蚕(Bombyx mori)的相似性最高.半定量分析结果表明,野桑蚕RPL21基因在野桑蚕幼虫的中肠、丝腺、脂肪体、血液、睾丸、表皮、卵巢和脑组织中均有表达,且转录水平无明显差异.[结论]野桑蚕RPL21基因进化较保守,在各组织中分布广泛且表达水平稳定.     

水稻CRE基因的克隆、分析及其高效表达载体的构建

基于GenBank中公布的水稻(Oryza sativa)基因组序列信息,设计特异引物,结合RT-PCR技术克隆水稻细胞分裂素受体(CTK response,CRE)基因的cDNA全长序列,并利用生物信息学工具进行初步分析。通过限制性内切酶将目的基因片段连接在载体pCAMBIA 1390-35S上,重组质粒分别通过PCR检测和酶切鉴定,成功获得水稻CRE基因的高效表达载体,可直接用于水稻的遗传转化研究。     

猪TPST1基因的克隆、序列分析及真核表达载体的构建

酪氨酸硫化转移酶(Tyrosylrotein sulfotransferase,TPST)在酪氨酸硫化修饰过程中起调节作用.试验参照人、鼠、牛等动物的TPST1 mRNA全长序列设计引物,通过电子克隆结合RT-RCR的方法首次克隆获得包括完整CDS区的猪TPST1基因cDNA序列(HQ439987),分析其核苷酸序列及...     

白桦扩展蛋白基因的克隆分析及植物表达载体构建

从白桦中分离了4条扩展蛋白家族基因全长c DNA序列和2条大于400 bp的部分c DNA序列,命名为Bp EXP1~Bp EXP5和Bp EXPL,其中4个全长c DNA推导蛋白氨基酸残基数为186~258个,编码蛋白的分子量为20.07~27.80 k Da,理论等电点为5.57~9.20。氨基酸序列分析结果表明:5个alpha-expansin序列有共同的结构特征,即在N-末端有8个保守的半胱氨酸残基的丰富域,C-末端有4个保守的色氨酸残基的丰富域,中间有1个组氨酸功能域。利用Real time RTPCR分析EXP家族基因在白桦不同器官和组织内的表达模式,结果表明:6个EXP基因在白桦的不同器官和组织中有着不同的表达水平,其中Bp EXP1在分生木质部中表达量最高,推测其与木材形成过程的细胞壁修饰相关;Bp EXP3在发育的蒴果中表达量最高,推测其与果实和种子发育过程中的细胞壁修饰相关。最后选择Bp EXP1和Bp EXPL基因,构建了pROKⅡ-Bp EXP1和pROKⅡ-Bp EXPL植物表达载体。     

水稻OsLEA2基因的克隆及表达分析

利用RT-PCR技术从水稻中克隆到OsLEA2的cDNA。序列分析表明,OsLEA2基因的读码框为312 bp,编码一个由103个氨基酸残基组成的蛋白,富含Ala、Lys、Glu、His、Val和Arg,不含Asn、Cys、Phe和Trp。OsLEA2蛋白的1～73位氨基酸残基形成LEA₁结构域。OsLEA2蛋白的二级结构有3个α-螺旋构象区域,没有伸展的β-片层构象,为亲水蛋白。进化树分析表明OsLEA2属于第4组LEA蛋白的4A亚组,OsLEA2与4A亚组LEA蛋白的氨基酸一致性为29%～45%。实时定量RT-PCR分析表明表明OsLEA2基因在水稻的不同生长发育时期的不同组织中都能表达,在完熟期的根和穗中,OsLEA2基因的表达明显升高。     

苜蓿MtCDPK1基因序列分析、克隆及表达载体构建

[目的]克隆苜蓿MtCDPK1基因,对其进行序列分析,并构建其表达载体。[方法]根据MtCDPK1基因的全长序列设计引物来克隆该基因,并用生物信息学方法对该基因表达的蛋白序列进行分析,最后通过酶切、连接、转化构建该基因的表达载体。[结果]试验成功克隆到了MtCDPK1基因,并证明MtCDPK1蛋白属于Ca2+依赖的蛋白激酶,同时成功构建了该基因的表达载体。[结论]该研究为苜蓿的遗传转化提供了良好的基础。     

水稻硅转运子基因的克隆与表达载体的构建

提取水稻根中总RNA,根据NCBI中水稻硅转运子基因Lsil(AB222272)、Lsi2(AB222273)的mR-NA序列设计2对引物,采用RT-PCR技术扩增硅转运子基因Lsil、Lsi2.并利用DNA重组技术分别构建了两个植物表达载体pCAMBIA2300-35S-Lsil-OCS和pCAMBIA2300-35S-Lsi2-OCS.克隆的水稻硅转运子基因Lsil、Lsi2与NCBI中已发表的核苷酸序列的同源性为99.33%、99.65%,氨基酸同源性都为100%.为后续培育其他硅转基因树木或农作物,增加其硅元素转运能力、提高其抗逆性奠定了实验基础.     

烟草H2A的序列分析、原核表达载体构建及诱导表达

[目的]对H2A进行序列分析及蛋白结构域分析,并将其克隆入p GEX4T-1原核表达载体进行诱导表达。[方法]以p GADT7-Rec-H2A质粒为模板,通过PCR扩增烟草H2A(3~140 Aa),将其插入原核表达载体p GEX-4T-1中,并将重组载体转入BL21(DE3)中,诱导其表达。[结果]构建了烟草H2A基因全长和p GEX4T-1载体大片段连接的融合表达载体,并成功地诱导其表达。[结论]该研究为运用Pull Down确定Nt Tkr与候选蛋白之间的体外互作进而确定Nt Tkr与蛋白互作的关键结构域奠定了试验基础。     

大熊猫核糖体蛋白S17亚基基因（rps17）的克隆及序列分析

RPS17蛋白是核糖体40S亚基的组成部分,由rps17基因编码.为了解大熊猫核糖体蛋白亚基rps17基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基rps17基因的异同,分别运用RT-PCR和PCR技术,从大熊猫肌肉组织的mRNA中成功克隆了核糖体蛋白亚基S17基因的cDNA序列以及从总DNA中成功克隆了S17基因的结构基因序列.序列分析发现,大熊猫核糖体蛋白亚基S17基因的表达序列长为457bp,开放阅读框(ORF)为408bp,编码135个氨基酸的蛋白质.结构基因序列长2 368bp,含有4个外显子和3个内含子.拓扑预测显示,核糖体蛋白亚基RPS17的相对分子质量为15.52×103,PI为10.26,含有5个类型的功能位点,即:5个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶II磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,1个N-豆蔻酰化位点及1个核糖体蛋白S17Esignature位点.进一步分析发现,该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物有很高的相似性,其蛋白质的高级结构除褐家鼠外与其它物种也具有一致性.对大熊猫rps17基因及其表达的蛋白质结构的比较研究,旨在丰富和完善哺乳动物r...     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

绵羊角细胞关联蛋白2基因克隆与表达分析

为克隆绵羊角细胞关联蛋白2(Keratinocyte-associated protein 2, KRTCAP2)基因mRNA并分析该基因表达分布规律,本研究首先提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR方法克隆KCTCAP2基因并进行两个品种间的比较分析,随后利用HRM方法对目的 SNP位点进行基因多态性分析,最后用q RT-PCR方法分析两个品种不同组织间KRTCAP2基因的时空表达分布。RT-PCR扩增显示绵羊皮肤组织出现略小于500 bp的特异性条带,测序证实该片段为KRTCAP2基因,长度为466 bp,编码149个氨基酸。所克隆的4条片段中存在4个SNP位点,其中2个SNP位点引起氨基酸位点突变。针对c.194位A>G突变位点设计的HRM检测发现小尾寒羊、新吉细毛羊等群体中并不存在该多态位点。小尾寒羊与新吉细毛羊不同组织间的表达分布显示,KRTCAP2基因存在多组织表达特性,在两品种羊组织表达模式既存在一致性也存在差异性。一致性主要表现为小尾寒羊与新吉细毛羊中肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠道与皮肤组织中KRTCP2表达量较心脏组织呈现上调表达的趋势。差异性表现为新吉细毛羊在肝脏、脾脏、肺脏、肠道、脑和皮肤的组织表达量均高于小尾寒羊,在肌肉和卵巢组织中的表达量低于小尾寒羊,在肾脏组织中的表达量基本持平。本研究成功克隆出绵羊KRTCAP2基因并进行了系统分析,为探讨绵羊角细胞功能奠定了基础。     

核糖体失活蛋白(RIP)基因克隆及其表达载体的构建

以按玉米RIP基因(M83927)序列设计合成的特异性引物,用提取的玉米基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增目的片段,测定并克隆玉米的RIP基因。序列分析表明,它们的核苷酸和氨基酸序列与GenBank中登录的CRIP(M83927)的同源性分别为99.90%和100%。RIP与植物表达载体pCAMBIA2301相连构建成为带有35S启动子和polyA终止子的植物表达载体p2301-RIP。     

小麦SnRK2.2基因克隆、表达载体构建及转化

SnRK2基因家族成员参与蛋白质的磷酸化,在植物抵御非生物胁迫方面发挥重要的作用。本研究以水稻SAPK2基因序列为基础,通过RT-PCR技术克隆得到一个新的小麦SnRK2基因,命名为Ta SnRK2.2,并提交到Gen Bank(登录号:KJ850253)。Ta SnRK2.2基因全长4 118 bp,由9个外显子和8个内含子组成,包含一个1 026 bp的开放阅读框,编码341个氨基酸。SnRK2.2基因序列在禾本科植物中高度保守,Ta SnRK2.2与水稻SAPK2以及玉米SnRK2.2亲缘关系较近。Ta SnRK2.2基因编码的蛋白质分子量为38.64 k D,理论等电点为5.45,含有SnRK2基因家族典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶保守结构域和多处磷酸化位点。构建了Ta SnRK2.2基因过表达载体,转化拟南芥,获得转基因植株,通过RT-PCR方法检测到Ta SnRK2.2基因在拟南芥中稳定表达。