H5亚型禽流感病毒HA基因在WISH细胞中的瞬时表达

在WISH细胞中,对H5亚型禽流感病毒HA基因进行了瞬时表达的研究。首先构建了真核表达质粒pVAX-H5HA,通过酶切和PCR筛选阳性克隆后测序。然后将重组表达质粒以脂质体介导法转染WISH细胞。通过RT-PCR在转录水平检测目的基因的表达,间接免疫荧光检测目的蛋白。结果表明,HA基因在WISH细胞中进行了表达。     

鸡传染性支气管炎病毒M基因真核表达载体的构建及免疫效力研究

从GenBank上下载鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120型标准株M基因的标准序列,以此标准序列为模板设计合成一对引物。从IBV尿囊液中提取总RNA,采用PCR技术扩增出M基因,将扩增出的目的片段克隆至pMD18-T载体上获得pMD18-IBV-M质粒,通过亚克隆将目的基因连接到经过改造的pEGFP-C1-SCP-SEC载体上,成功构建真核表达质粒pC1-IBV-M。通过间接免疫荧光试验验证了构建的真核载体能在真核细胞内表达,通过动物免疫试验来检测该真核表达载体对动物的免疫保护情况。     

密码子优化的甲型H1N1流感病毒HA/HA1基因真核载体的构建及初步表达

【目的】构建甲型流感病毒H1N1血凝素基因HA/HA1的真核表达载体,并检测其在BHK-21细胞中的表达。【方法】按照人的偏爱密码子,对H1N1流感病毒的HA/HA1基因进行优化改造,以提高其表达量,经全基因合成后插入到真核表达载体pSNAV中,构建了真核表达质粒pSNAV-Mod. HA与pSNAV-Mod. HA1;质粒转染BHK-21细胞,G418筛选后,用免疫荧光及Western blot技术检测其表达情况。【结果】成功构建了血凝素基因HA/HA1的真核表达载体。经G418筛选得到单克隆,免疫荧光技术和Western blot检测10代,显示Mod. HA和Mod. HA1皆可在BHK-21细胞中稳定表达。【结论】成功构建的流感病毒HA和HA1真核表达载体,可为今后开展多基因表达的基因工程疫苗及H1N1检测试剂奠定基础。     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因真核表达载体的构建与表达

为了构建犬瘟热病毒F基因真核表达载体,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的F基因,将其克隆至pMD-18T载体上,用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因亚克隆至pcD-NA3.1(+)中,获得真核重组质粒pcDNA3.1-CDVF。通过脂质体介导法将pcDNA3.1-CDVF转染至BHK-21细胞中,并利用间接免疫荧光试验和RT-PCR法检测pcDNA3.1-CDVF在BHK-21细胞中的表达情况。结果表明,真核重组表达质粒pcDNA3.1-CDVF构建成功,F基因可在BHK-21细胞中表达。     

3-1E/mChIL-15融合基因构建及在真核细胞中的表达

将鸡堆形艾美尔球虫(E.acervulina)子孢子和裂殖子表面抗原3-1E基因片段与鸡白细胞介素15成熟蛋白基因片段(mChIL15)通过四个柔性氨基酸SPGS连接,构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1/3-1E-linker-mChIL-15。表达质粒纯化后应用磷酸钙法体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光和免疫组织化学方法对重组质粒的体外瞬时表达进行检测。结果表明,成功构建了融合基因3-1E-linker-mChIL-15,转染后30h可检测到融合基因编码的融合蛋白在293T细胞中的瞬时表达。研究为鸡艾美尔球虫基因工程疫苗进一步研制及应用奠定了基础。     

三种鸭防御素真核表达载体的构建及其表达分析

为研究鸭防御素的真核表达,人工合成了鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因,并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒;重组表达质粒经酶切鉴定正确后,分别转染HEK293细胞进行表达,用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中;真核表达质粒转染HEK293细胞24 h后,在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达;RT-PCR能检测到目的基因mRNA,但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带。     

犬瘟热病毒基因疫苗表达载体构建及在真核细胞中的表达

利用pCI载体构建了犬瘟热病毒基因疫苗表达载体质粒pCIF和pCIN,通过脂质体介导法将这两种真核表达质粒分别转染MDCK细胞,用RT-PCR法进行转录水平的检测,并用间接ELISA法检测目的蛋白是否表达。结果表明,真核表达质粒pCIF和pCIN已被成功构建,这两种重组质粒转染MDCK细胞72h后就可检测到目的基因的转录和两种目的蛋白的表达,表达的蛋白均能与抗CDV抗体发生特异性的抗原抗体反应。这为研究预防犬瘟热的基因疫苗奠定了良好的基础。     

小鼠p300-HAT真核表达质粒的构建

[目的]构建小鼠p300-HAT的真核表达质粒。[方法]利用PCR技术扩增p300的HAT域,然后构建p300的HAT域的真核表达质粒（p300-HAT—EGFP）,并通过PCR验证和酶切验证重组质粒的正确性;提取不舍内毒素的质粒,转染HepG2细胞,通过观测绿色荧光检测转染效率。[结果]PcR产物的电泳结果显示,成功扩增了小鼠p300基因HAT结构域,构建了小鼠p300基因HAT结构域的真核表达质粒,将其命名为m-p300-HAT-pEGFP—C1。重组质粒可以成功表达融合绿色荧光蛋白目的基因蛋白。[结论]p300-HAT—EGFP重组质粒的成功构建为后续开展巨噬细胞NF—kB信号通路的研究奠定了基础。     

含CpG序列PRRSV SD2 E基因真核表达载体质粒构建及表达

为了提高猪生殖与呼吸综合征病毒山东株(PRRSV SD2株)基因免疫的效果,将PRRSV SD2 E基因插入哺乳动物表达载体PVAX1中,构建出PVAX1-E质粒。再将已筛选出的CpG-ODN序列通过在其两端的粘性酶切末端定向插入含PVAX 1-E的真核表达载体,构建含CpG基因序列真核重组表达质粒CpG-pVAX 1-E。将重组质粒转染COS-7细胞,经RT-PCR检测E基因mRNA的转录和间接免疫荧光试验(IFA)证实:CpG-pVAX 1-E可表达PRRSV GP5蛋白。试验结果为进一步研究PRRSV SD2 ORF5动物免疫反应奠定基础。     

真核表达载体pCDNA3-CaBP-D28k的构建及细胞表达

构建钙结合蛋白D28k(calbindin-D28k,CaBP-D28k)真核表达载体,并证实了其在真核细胞COS-1中的表达情况,为进一步研究该重组载体在动物体内的表达奠定了基础。通过酶切方法自含鸡CaBP-D28k基因的克隆质粒pGEM-T-CaBP-D28k中扩增CaBP-D28k基因,并将其克隆到真核表达载体pCDNA3中,阳性克隆鉴定后,在PEI作用下转染COS-1细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了CaBP-D28k在COS-1中的表达。     

GPC3-siRNA真核质粒载体的构建及Huh-7细胞转染

目的探讨GPC3-siRNA真核质粒载体构建并转染Huh-7细胞的可行性。方法构建真核质粒载体pcDNA3.1＋GPC3和GPC3-siRNA-1633,采用脂质体法瞬时转染至Huh-7细胞中。MTT法检测转染后Huh-7细胞的细胞活性,荧光定量PCR、Western blot分别检测GPC3 mRNA和蛋白表达。结果 GPC3-siRNA-1633基因和GPC3真核质粒载体转染Huh-7细胞后细胞存活率高,转染GPC3-siRNA-1633的Huh-7细胞出现GPC3 mRNA和蛋白表达下调。结论 GPC3-siRNA-1633可成功转染至Huh-7细胞,并抑制GPC3表达。     

牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达

为构建牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达质粒,根据GenBank牛瑟氏泰勒虫p23表面蛋白基因序列（D84447）,分别设计2对特异性引物,利用全血基因组DNA提取试剂盒提取牛瑟氏泰勒虫基因组DNA,采用SOE—PCR技术构建双拷贝p23基因,克隆到pMD-18-T载体上,经过PCR、酶切鉴定及测序后,亚克隆到pVAX-Ⅰ真核表达载体上,经过鉴定后采用脂质体法将重组质粒pVAXI-2p23转染到BHK-21细胞,用IFA和RT—PCR来鉴定目的基因的表达情况．结果表明,成功构建了牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中获得表达．     

原核真核双表达加强型绿色荧光蛋白质粒的构建

将原核启动子Ptrc和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因从EGFP原核表达质粒pYA3334—EGFP上切下，然后将其插入至真核表达质粒pVAXI真核启动子Pcmv的下游，构建成具有真核和原核启动子的双表达杂合质粒pVAXD-EGFP，其长度为3823bp。将pVAXD—EGFP分别转化鼠伤寒沙门氏菌X4550和转染COS—7细胞，应用流式细胞术、可见光谱扫描、SDS—PAGE测定EGFP原核表达；应用荧光显微镜观察EGFP在COS—7细胞内的表达。重组鼠伤寒沙门氏茵X4550(pVAXD-EGFP)表达EGFP的量与仅以原核方式表达EGFP的X4550(pYA3334—EGFP)相当；将质料pVAXD-EGFP转染COS—7细胞，EGFP可在COS—7细胞核和胞浆表达，在荧光显微镜下发出强烈荧光。结果表明：不仅成功地构建原核、真核表达集中于同一质粒的新型质粒pVAXD-EGFP，而且原核、真核目的蛋白表达量达到很高水平，显示其在新型重组细菌疫苗方面有着诱人的应用前景。     

犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

[目的]构建犬细小病毒(CPV) VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]参考GenBank中发表的CDV N蛋白基因序列设计引物,采用RT - PCR方法从疑似犬瘟热病犬全血样品中扩增CDV N蛋白基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).经测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达CDV N蛋白基因,8h取其肝脏提取总RNA,进行RT - PCR方法扩增.[结果]在病犬的全血样品中扩增得到1 572 bp的CDV N蛋白基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)- CDV N,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]构建了犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达.     

人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体的构建及转染

目的：构建携带人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合表达载体,并转染人胚肺成纤维细胞,为研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础．方法：以重组质粒pcDNA3．1／lif为模板,PCR扩增LIF基因,将扩增片断双酶切后连接到质粒pEGFP-N1中,形成重组表达载体pEGFP—N1／lif．并用脂质体法转染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察,RT—PCR及Western杂交检测融合蛋白的表达．结果：成功构建融合表达载体pEGFP—N1／lif,在人胚肺成纤维细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP—LIF．结论重组pEGFP—N1／lif载体构建成功,可用于标记LIF蛋白、为进一步研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础．     

鸡IL-18重组真核表达载体的构建及其对ND灭活苗的佐剂作用

从pGEM-ChIL-18克隆质粒扩增获得鸡IL-18(ChIL-18)全基因片段,并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ChIL-18(简称pChIL-18).经PCR、酶切和基因测序证实,所获重组质粒含有目的片段,且连接、构建正确.pChIL-18转染Cos7细胞,转染细胞中含ChIL-18基因的mRNA,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用.pChIL-18对ND灭活苗免疫增强作用的研究表明pChIL-18能够提高ND灭活苗诱发的细胞免疫应答,为后续基因疫苗的研究奠定基础.     

猪瘟病毒DNA疫苗的构建及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)C株E2囊膜蛋白全长基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游,采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞,流式细胞仪(FACS)检测293T细胞瞬时表达了E2囊膜蛋白。将构建的重组质粒肌肉注射BALB/c小鼠,用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测证明成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体,为下一步利用DNA疫苗免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

GPC3过表达载体的构建和表达检测

目的构建并检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3,GPC3）真核表达重组质粒。方法提取肾组织RNA进行逆转录,扩增GPC3基因的编码区,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,酶切鉴定并测序;将克隆成功的质粒转染至Huh7细胞,用荧光定量PCR和Western blot检测GPC3的表达水平。结果成功扩增GPC3编码区,并克隆至载体pcDNA3.1中;GPC3过表达载体转染至Huh7细胞后,荧光定量PCR和Western Blotting检测结果显示GPC3mRNA和蛋白表达水平均明显增加。结论成功构建GPC3过表达载体可用于后续研究。     

玉米ZmCPK12基因真核表达载体的构建及转化

[目的]CDPK是一类依赖于Ca2+而不依赖CaM及磷脂的蛋白激酶,或类钙调素结构域的蛋白激酶,是植物和低等动物所特有.研究为玉米CDPK基因家族在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmCPK12基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.实验利用RT - PCR技术扩增得到大小为1 533 bp的玉米ZmCPK12基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP -5N连接,获得重组真核表达质粒ZmCPK12 - 5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmCPK12-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转人酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米mCPK12基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

马立克氏病病毒VP22基因siRNA筛选体系的构建

将马立克氏病病毒（MDV）超强毒株VP22基因插入真核表达载体pEGFP-C1中EGFP基因的下游，构建EGFP-VP22融合基因真核表达载体pEGFP-VP22。将其转染至中国仓鼠卵巢细胞（CHO-k1）中，通过荧光显微镜观察EGFP的表达情况，并用RT-PCR检测VP22基因的表达。检测证实EGFP和VP22在CHO细胞中均得到了有效表达。