γ射线对甘薯小象甲的不育研究

本文报导了用γ射线处理甘薯小象甲取得的研究结果.抑制卵和幼虫发育为50戈瑞.处理羽化前2～3天蛹,50戈瑞基本使其不育.70戈瑞以上则完全不育.成虫比蛹需要量更大.完全不育的成虫寿命是未处理的一半.50～70戈瑞不影响成虫交尾能力,100戈瑞对雄虫产生生殖机能障碍.     

Chelex100法提取甘薯小象甲DNA及云南地区甘薯小象甲的分子鉴定

甘薯小象甲是国内外重要的检疫性害虫,除本身为害薯块外,引起的伤口还会诱致病菌侵入,使受害薯块发生恶臭和苦味无法食用。准确鉴定云南地区的甘薯小象甲,特别是研究其遗传变异可为检疫提供依据。本研究采集了云南元谋县甘薯小象甲,采用Chelex-100法快速提取甘薯小象甲基因组DNA,分别对雌雄成虫rDNA ITS-1序列进行系统发育分析,首次发现云南元谋县的甘薯小象甲属于东亚分支的东南亚亚支,与我国之前报道的甘薯小象甲属于东亚分支的东北亚亚支不同,说明云南元谋县的甘薯小象甲种群来源与中国广东、福建、浙江和重庆的种群来源不同。     

取食Cry3Aa蛋白后黄曲条跳甲成虫中肠组织的病理变化

为明确Cry3Aa蛋白对黄曲条跳甲成虫的致死效果及作用机理,采用浸叶法测定了黄曲条跳甲成虫取食Cry3Aa蛋白后的死亡情况,并利用透射电镜观察了Cry3Aa蛋白处理后成虫中肠组织的病理学变化。结果显示,取食浓度为2 mg/mL的Cry3Aa蛋白6 d和12 d后黄曲条跳甲成虫的死亡率分别为33.33%和77.78%;透射电镜观察发现,蛋白处理后成虫中肠发生了明显的病理变化,并且随着时间的延长,病理变化更加明显,主要表现为：柱状细胞变形、细胞间隙增大、微绒毛缩短并肿胀、线粒体变形、内质网肿胀。本研究表明黄曲条跳甲成虫中肠是Cry3Aa蛋白的重要作用部位,研究结果为揭示Cry3Aa蛋白对黄曲条跳甲成虫的作用机理奠定了基础。     

Cry9Aa3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的最小活性区研究

为了确定Cry9Aa3蛋白对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)的最小活性区,根据NCBI BLAST比对结果与SWISS-MODEL同源建模结果,设计了12对截短引物,以cry9Aa3全长序列为模板,扩增出了12种不同截短片段,与pEB载体重组后的阳性克隆,转入大肠杆菌(Escherichia coli)菌株Rosetta(DE3)诱导表达,提取蛋白。对小菜蛾和亚洲玉米螟的生物学活性测定,发现截短蛋白Cry9Aa3-45~700、Cry9Aa3-1~654,对小菜蛾和亚洲玉米螟有较高的活性,其中截短蛋白Cry9Aa3-45~700对小菜蛾和亚洲玉米螟的LC50分别为5.27、7.56μg/g,截短蛋白Cry9Aa3-1~654对小菜蛾和亚洲玉米螟的LC50分别为7.76、7.79μg/g,与阳性对照无显著差异,而截短蛋白Cry9Aa3-1~653和Cry9Aa3-46~700(LC50200μg/g)对幼虫几乎丧失生物学活性。这说明Cry9Aa3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的杀虫活性区相同,最小活性区位于45I和654P之间。     

Cry类和Vip3Aa类Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力和增效作用

筛选对靶标害虫高效的Bt杀虫蛋白、评价蛋白组合对靶标害虫的杀虫作用,对于转基因抗虫新品种的研发具有重要的指导意义。本文采用人工饲料混合法评价了Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ca、Cry1Ba、Cry2Aa、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19共8种Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力;同时评估了Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合蛋白对亚洲玉米螟的杀虫作用,筛选出毒力最佳的组合比例。结果表明：Cry1Ab、Cry1Fa、Cry2Aa对亚洲玉米螟的LC₅₀在0.24～0.72μg/g之间,其中Cry1Ab的毒力最强,显著高于Cry1Fa和Cry2Aa蛋白,Cry1Fa与Cry2Aa毒力无显著性差异。Cry1Ca、Cry1Ba、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19对亚洲玉米螟的LC₅₀均大于50μg/g。当Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合比例为1∶1时,增效作用最强,增效因子分别为3.18和1.58。本研究结果为多价转基因玉米的研发提供了重要依据。     

对绿盲蝽具有杀虫活性Bt菌株的筛选及Cry15Aa蛋白活性的研究

Bt棉有效控制了棉田主要害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera),然而原来处于次要地位的刺吸式口器害虫盲蝽(Heteroptera:Miridae)为害逐年加重,目前对绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür)有效的抗虫基因未见报道。本研究以本实验室保存的Bt杀虫基因和菌株为材料,对绿盲蝽进行杀虫活性筛选。利用本实验室先前克隆的Mtx类杀虫基因cry15Aa表达产物进行绿盲蝽杀虫活性测定,研究结果显示Cry15Aa蛋白对绿盲蝽具有一定的杀虫活性。通过杀虫活性测定,获得对绿盲蝽有效的Bt菌株20株;对这些菌株表达蛋白进行质谱鉴定,LC-MS/MS质谱鉴定结果显示,这些菌株可能含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ba、Cry1Be、Cry8Ha等十余种对鳞翅目、鞘翅目害虫有杀虫活性的蛋白片段,并且有4株Bt菌株样品中检出了Mtx类杀虫蛋白Cry15Aa的片段。但是进一步基因鉴定结果表明,这4株菌株并不含有cry15Aa全长基因,推测这些菌株中含有Cry15类的新基因。上述研究结果表明这些菌株中可能存在对盲蝽有效的新型杀虫蛋白。本研究在发现了cry15Aa基因所表达的蛋白对绿盲蝽具有杀虫活性的同时,获得了对绿盲蝽具有杀虫活性的Bt新菌株,对绿盲蝽的生物防治具有重要的意义。     

甘薯小象甲(鞘翅目:象虫科)对伽玛射线的敏感性

本文研究了伽玛射线对甘薯小象甲[Cylas formicarius elegantulus(Summers)]的效果。在5—20千拉德(krad)的剂量范围中,任何一种处理均使卵不能孵化。当处理剂量高于5千拉德时,发育12天的幼虫就不能发育至蛹。处理剂量在5—50千拉德范围内,任何一种水平的处理均不能羽化出成虫。当发育5天的蛹被辐射后,在高于或等于35千拉德剂量的情况下,没有正常成虫羽化出来。5千拉德剂量对蛹期的处理足以能使成虫不育。在任何处理中,高温都能加速死亡,且随辐射剂量增大,成虫存活时间缩短,在照射100千拉德后,成虫不取食,32℃下7天,27℃下11天就全部死亡。处以75千拉德时,成虫生殖能力就显著降低了。当雄虫处以30千拉德,雌虫处以20千拉德时,即完全不育了。     

Cry1Ba3蛋白对亚洲玉米螟杀虫活性测定及其与BBMVs的结合分析

提取并纯化Cry1Ba3蛋白截短片段,用饲喂人工饲料的方法对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）初孵幼虫进行生物活性测定。结果显示,Cry1Ba3截短片段对亚洲玉米螟有良好的杀虫活性（LC50=5.29 μg/g,95%置信限为3.96～7.10 μg/g）。而纯化的Cry1Ac蛋白60 ku的活性片段对亚洲玉米螟初孵幼虫的杀虫活性LC50为0.83 μg/g。提取亚洲玉米螟5龄幼虫的BBMVs,用纯化的Cry1Ba3和Cry1Ac蛋白进行竞争结合试验,结果显示Cry1Ba3与Cry1Ac在亚洲玉米螟中肠的结合没有竞争作用,说明两种毒素在亚洲玉米螟BBMVs上可能存在不同的受体。     

甘薯褪绿矮化病毒RNase3蛋白的原核表达及抗血清制备

以本实验室保存的重组质粒为模板,利用PCR方法扩增获得了甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的RNase3基因,RNase3基因由690个核苷酸组成,编码229个氨基酸。将RNase3基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE分析。结果表明,RNase3在大肠杆菌中能高效表达,融合蛋白分子量约为26.5kD。以表达的融合蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPCSV-RNase3的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清对RNase3融合蛋白的效价达10万倍。     

国产Bt-Cry1Ab和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米对草地贪夜蛾的抗性测定

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)是世界性重大农业害虫。种植转基因Bt作物是主要的防治手段之一。我们利用室内生物测定方法评价了国产Bt-Cry1Ab玉米(转化体C0030.3.5)和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米(转化体DBN3601和DBN3608)对草地贪夜蛾1~4龄幼虫的毒力。结果显示,供试两种转基因玉米共6个品种皆可高效表达目标杀虫蛋白并对草地贪夜蛾具有很强的毒杀作用,对1龄幼虫的致死率达到59%~100%,存活幼虫的生长发育亦受到显著抑制。表明国内研发的Bt-Cry1Ab玉米和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米对草地贪夜蛾具有良好的控制效果,其中Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米的防治效果显著优于Bt-Cry1Ab玉米,两种转基因玉米皆具有较好的商业化应用前景。     

类钙粘蛋白对Cry3A毒素杀虫活性的影响

将克隆的黄粉虫类钙粘蛋白基因片段在大肠杆菌中表达纯化,并分析其对Cry3A毒素杀虫活性的影响,从而探讨黄粉虫类钙粘蛋白对Cry3A毒素杀虫活性的增效作用。黄粉虫类钙粘蛋白基因片段在大肠杆菌中表达产物为包涵体,经尿素变性后,用亲和纯化法可得到较纯的重组蛋白;随着类钙粘蛋白片段与Cry3A质量比值的升高,Cry3A毒素对黄粉虫的杀虫活性也逐步提高,当其比值为1时,活性达到最大,提高了2.5倍,而黄粉虫类钙粘蛋白片段对Cry3Am的杀虫活性却没有显著性影响。研究表明,黄粉虫类钙粘蛋白对Cry3A毒素的杀虫活性具有增效作用。