嗜水气单胞菌外膜蛋白基因DNA疫苗载体的构建及分析

为构建嗜水气单胞菌的DNA疫苗载体,根据已发表的该菌外膜蛋白基因momp的核苷酸序列设计一对特异性引物,应用PCR技术,扩增到嗜水气单胞菌L316的主要外膜蛋白基因,并插入到真核表达载体pcDNA3上,构建成DNA疫苗,命名为pcDNA3-POMP。以纯化的原核表达蛋白GST-POMP免疫SD大鼠制备抗血清,用ELISA测定抗体效价达到1∶100 000以上;用pcDNA3-POMP质粒转染293细胞,转染48h后收集细胞,提取细胞的RNA进行RT-PCR,检测到外源基因的表达。至此,初步完成嗜水气单胞菌DNA疫苗表达载体的构建,为进一步疫苗免疫和效价的检测奠定基础。     

鱼用嗜水气单胞菌口服疫苗的免疫保护效应

目的：制备含嗜水气单胞菌被膜或全菌的PLG疫苗微粒。以草鱼为实验动物，研究疫苗微粒的免疫保护效应。方法：采用复乳挥发法制备PLG疫苗微粒，草鱼口服免疫在4周内进行3次（每次10mg微粒），用ELISA法测定血清和肠粘液的抗体变化，保护效应用细菌攻击实验检测。结果：获得被膜和全菌的PLG疫苗微粒，蛋白含量分别为2．31％，6．12％，2种疫苗微粒均可诱导血清及肠粘液抗体应答。腹腔接种20LD50嗜水气单胞菌后，被膜、全菌疫苗微粒组的存活率分别为46．7％和36.7％，相对存活率分别为42．9％和32．1％，接受空微粒的草鱼仅有6．7％的存活率。结论：被膜、全菌疫苗微粒对草鱼均有显著免疫保护效应。可作为预防嗜水气单胞菌感染的疫苗。     

鳖嗜水气单胞菌疫苗的试制

嗜水气单胞菌能引起人和动物的疾病。我国的许多淡水鱼类的暴发病病原是嗜水气单胞菌［孙其焕等1991，陈怀青和陆承平1991］。暴发病的流行造成巨大的经济损失，严重影响了我国渔业的发展。近年来各种名特水产品的养殖也正在受这种细菌的危害［孙佩芳等1996，陆宏达和金丽华1996］。一味地应用抗生素及化学药物将会带来很多不良后果，且效果不很明显。因此开发一种有效的疫苗势在必行。国外商品性鱼用疫苗在七十年代中已开始生产，国内也在研究试制［杨先乐等1989，许淑英等1994，孙建和和陆承平1995］。本实验室人员从患穿孔病的鳖上分离到…     

鳖嗜水气单胞菌疫苗的试制

嗜水气单胞菌能引起人和动物的疾病。我国的许多淡水鱼类的暴发病病原是嗜水气单胞菌［孙其焕等1991,陈怀青和陆承平1991］。暴发病的流行造成巨大的经济损失,严重影响了我国渔业的发展。近年来各种名特水产品的养殖也正在受这种细菌的危害［孙佩芳等1996,陆宏达和金丽华1996］。一味地应用抗生素及化学药物将会带来很多不良后果,且效果不很明显。因此开发一种有效的疫苗势在必行。国外商品性鱼用疫苗在七十年代中已开始生产,国内也在研究试制［杨先乐等1989,许淑英等1994,孙建和和陆承平1995］。本实验室人员从患穿孔病的鳖上分离到…     

嗜水气单胞菌灭活疫苗对鲫鱼的免疫效果

随着食品安全等问题日趋严重,寻找良好而安全的防治细菌性疾病的方法迫在眉睫。本研究利用从患病鲫鱼体内分离的嗜水气单胞菌制备灭活疫苗,用(50±5) g的健康鲫鱼作为试验对象,免疫组腹腔注射制备的疫苗,对照组腹腔注射等量的磷酸缓冲液。二次免疫后1、7、14、21、28 d检测血清凝集效价、血清中溶菌酶活性和酸性磷酸酶活性;二次免疫28 d后,对免疫组和对照组同时腹腔注射嗜水气单胞菌进行攻毒,观察鲫鱼生长状况,记录死亡量。结果表明,免疫组血清凝集效价在免疫后逐渐升高,在21 d达到峰值,明显高于对照组;血清中溶菌酶活性和酸性磷酸酶活性都于免疫后14 d达到峰值,明显高于对照组;攻毒结果显示,免疫组死亡率10.0%,对照组死亡率83.7%,相对保护率达到88.5%。说明制备的嗜水气单胞菌灭活疫苗可以诱导鲫鱼产生免疫应答反应,对嗜水气单胞菌的感染具有较好的免疫保护作用。     

浅谈嗜水气单胞菌疫苗的研究进展

生产有效的嗜水气单胞菌疫苗是控制和预防目前引起人-兽-鱼共患病病原嗜水气单胞菌的关键。本文阐述了嗜水气单胞菌疫苗及佐剂的研究进展。     

鱼用嗜水气单胞菌口服疫苗的免疫保护效应

目的:制备含嗜水气单胞菌被膜或全菌的PLG疫苗微粒,以草鱼为实验动物,研究疫苗微粒的免疫保护效应.方法:采用复乳挥发法制备PLG疫苗微粒,草鱼口服免疫在4周内进行3次(每次10 mg微粒),用ELISA法测定血清和肠粘液的抗体变化,保护效应用细菌攻击实验检测.结果:获得被膜和全菌的PLG疫苗微粒,蛋白含量分别为2.31%,6.12%,2种疫苗微粒均可诱导血清及肠粘液抗体应答.腹腔接种20 LD50嗜水气单胞菌后,被膜、全菌疫苗微粒组的存活率分别为46.7%和36.7%,相对存活率分别为42.9%和32.1%,接受空微粒的草鱼仅有6.7%的存活率.结论:被膜、全菌疫苗微粒对草鱼均有显著免疫保护效应,可作为预防嗜水气单胞菌感染的疫苗.     

嗜水气单胞菌322A的外膜蛋白及其抗原性

用十二烷基肌氨酸钠抽提结合超速离心的方法提取一株日本鳗鲡致病性嗜水气单胞菌322A和其他4株气单胞菌标准菌株的外膜蛋白(Omp);通过SDS-PAGE分析比较这5株气单胞菌Omp的组成.结果表明,5株气单胞菌的Omp电泳可得到5-13条条带,其分子质量主要集中在20-50 ku之间,且28 ku的Omp为5株气单胞菌所共有.用罗非鱼感染322A全菌后的恢复期血清进行蛋白质印迹试验的结果显示,322A的Omp条带中有4条发生阳性反应,其分子质量分别为28、37、43和45 ku.用兔抗322A Omp的血清进行蛋白质印迹试验的结果显示,322A的Omp条带中有5条发生阳性反应,其分子质量分别为28、33、37、43和45 ku.不同抗血清的印迹结果提示了322A数条主要Omp具有免疫原性,有望成为疫苗研发的候选材料.     

嗜水气单胞菌相关毒力基因的研究进展

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是人、畜和水生动物共患的条件致病菌。目前发现其致病性与多种毒力因子相关。主要对外毒素、外膜蛋白和信号相关蛋白等毒力因子相关基因的研究进展作一综述,为嗜水气单胞菌病的鉴定、预防和治疗提供参考。     

嗜水气单胞菌超微结构的研究

嗜水气单胞菌的代表株Ｊ－Ｉ负染显示它具有一端生单鞭毛及周身菌毛,菌毛有两种形态：一种是短而硬,数量多,另一种是细而长,易弯曲,数量少。不同的培养条件影响菌毛、Ｓ蛋白的表达。     

壳聚糖对受免尼罗罗非鱼生长和免疫功能的影响

以初始体重(99.98±2.79) g的尼罗罗非鱼(Oreoehromis niloticus)为研究对象,探讨饲料中添加壳聚糖对其生长和免疫功能的影响。在饲料中添加剂量为0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%的壳聚糖,连续投喂经注射接种嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的尼罗罗非鱼30d后,测定血清中抗体效价,60d后测量其相对增重率、特定生长率、饲料效率、蛋白质效率、酸性磷酸酶活性、溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性以及活菌攻毒后的免疫保护率。结果表明,用添加量为0.6%壳聚糖的饲料投喂受免罗非鱼,不仅可以提高生长速度,还能提高受免罗非鱼对嗜水气单胞菌的免疫应答水平,增强其非特异性免疫力和抵抗嗜水气单胞菌人工感染能力。     

免疫多糖(酵母细胞壁)对黄鳝免疫保护力的增强作用

在饲料中添加不同剂量的免疫多糖(酵母细胞壁),连续投喂经注射接种嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)的黄鳝(Monopterus albus)28 d后,通过测定供试黄鳝的增重量、血清中凝集抗体效价、溶菌酶活性、谷丙转氨酶活性(SGPT)、血清总蛋白含量、白细胞吞噬活性以及活菌攻毒后的免疫保护率(RPS),探讨了将LPS作为免疫原、免疫多糖作为免疫刺激剂结合使用对受免黄鳝免疫保护力的增强作用。结果表明,用添加100.0 mg/kg免疫多糖的饲料投喂受免黄鳝,不仅可以提高受免黄鳝对A.hydrophilaLPS的免疫应答水平,也可以增强黄鳝的非特异性免疫力和抵抗A.hydrophila人工感染的能力,同时也证明了在饲料中添加免疫多糖对黄鳝的生长速度和肝脏功能均无不良影响。     

免疫多糖对受免黄鳝免疫保护力的增强作用

在饲料中添加不同剂量的免疫多糖(酵母细胞壁),连续投喂经注射接种嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的黄鳝(Monopterus albus)28 d后,通过测定供试黄鳝的增重量、血清中凝集抗体效价、溶菌酶活性、谷丙转氨酶(SGPT)活性、血清总蛋白含量、白细胞吞噬活性以及活菌攻毒后的免疫保护率(RPS),探讨了将LPS作为免疫原、免疫多糖(酵母细胞壁)作为免疫刺激剂结合使用对受免黄鳝免疫保护力的增强作用。结果表明,用添加100.0 mg/kg免疫多糖(酵母细胞壁)的饲料投喂受免黄鳝,不仅可以提高受免黄鳝对A.hydrophila LPS的免疫应答水平,也可以增强黄鳝的非特异性免疫力和抵抗A.hydrophi-la人工感染的能力,同时也证明了在饲料中添加免疫多糖(酵母细胞壁)对黄鳝的生长速度和肝脏功能均无不良影响。     

鲫细菌性疾病控制中甲砜霉素药代-药效动力学联合参数的研究

采用高效液相色谱法,研究了甲砜霉素对致病性嗜水气单胞菌AH10(Aeromonas hydrophila)体外药效学参数及口灌不同剂量的甲砜霉素在鲫体内药代动力学特征,并制定甲砜霉素控制鲫细菌性败血症防耐药突变用药方案。研究结果表明,甲砜霉素对AH10的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations,MIC)为1.0μg/mL;最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentrations,MBC)为2.0μg/mL;防细菌耐药突变浓度(mutant prevention concentration,MPC)为8.0μg/mL;防耐药突变选择窗(mutant selection window,MSW)为1.0~8.0μg/mL。在试验水温(22±1)℃条件下,对鲫口灌20、30、40 mg/kg体重剂量的甲砜霉素,24 h内血药浓度大于MPC的维持时间分别为3、8、22 h;AUC24(area under the drug concentration-time curve)/MIC分别为89.539、174.560、251.682;Cmax(maximum concentration in the interval)/MIC分别为14.92、17.69、24.22;。综合血药浓度维持MPC以上的时间超过24 h、AUC24/MIC125或Cmax/MIC10等指标,建议甲砜霉素控制鲫细菌性败血症的防耐药用药方案为:剂量40 mg/kg,一日一次。根据肌肉内甲砜霉素的药动学方程,药残达到国家限量标准所需时间约为15 d,所以在本试验水温(22±1)℃下,建议休药期不低于15 d。     

基于I-FABP的鲫肠道通透性检测方法的建立

肠道通透性与肠道稳态及个体健康状况直接相关,目前尚缺乏鱼类肠道通透性的定量评价方法及试剂。血清中肠脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid binding protein,I-FABP）是肠道通透性的重要血清生物学指标,可用于肠道通透性的定量评价。为建立鲫（Carassius auratus）血清I-FABP的定量检测方法,克隆了鲫I-FABP基因,经原核表达和纯化,并利用重组蛋白分别免疫新西兰白兔（New Zealand white rabbit）及小鼠（Mus musculus）,制备了兔源及鼠源多克隆抗体,其效价均为1∶80 000。以纯化的兔源多克隆抗体作为包被蛋白,以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的鼠源多克隆抗体作为酶标抗体,通过优化各反应条件建立了基于鲫I-FABP的双抗体夹心酶联免疫检测方法（double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA）。标准曲线的线性回归方程为y=0.003 5x+0.036 7,拟合度较高R²为 0.999 1,临界值为0.090 6。批内及批间变异系数分别为1.17%～5.50%及0.16%～4.78%,具有较好的重复性。以该方法对54份样品进行检测,与商业化试剂盒对比,符合率为100%。构建的DAS-ELISA检测方法可用于鲫肠道通透性的定量评估。鉴于鱼类I-FABP的保守性,该方法或可用于其他鱼类肠道通透性的定量评价。