烟草青枯菌Tn5突变体库的构建及突变位点分析

为了从烟草青枯菌全基因组范围内发掘致病性相关基因,采用电转化法构建了一个EzTn5转座子介导的烟草青枯菌TXLLJ14-3菌株插入突变体库,该突变体库包含1.2万个突变子,经烟草上的致病性检测,共得到216个无致病力或弱致病力突变菌株。利用TAIL-PCR扩增获得其中15个无致病力烟草青枯菌的Tn5侧翼序列,并对其插入位点进行了分析,结果表明,15个突变菌株的插入位点分别位于核苷酸水解酶、糖基转移酶、转座酶和合成酶等具有不同功能的基因上,这些基因受到干扰或破坏后,可能会抑制致病相关物质的表达或分泌,或者诱导烟草对病原菌产生抗性,从而表现出无致病力特征。     

利用电转化法构建烟草野火病菌的Tn 5插入突变体

采用电转化法将含有kanr基因标记的EZ::Tn 5转座子插入到烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv. tabaci)的基因组中.结果表明,在电压为2 400 V条件下,供试的烟草野火病菌菌株SMX 006及WT 4的电转化效率分别为0.8×103,4.2×103 cfu·μg-1 DNA.转化电压下降至1 800 V时,WT 4菌株的转化效率也随之下降至1.64×103 cfu·μg-1 DNA.对转化子进行kanr筛选以及特异性PCR鉴定,表明Tn 5可以稳定地插入到受体菌的基因组中.对烟草野火病菌SMX 006的Tn 5插入突变体进行了多次致病性﹑运动性和胞外蛋白酶活性测定,从中获得了2个致病力明显减弱的突变株(H 028,H 029)、1个运动能力明显减弱的突变株(H 028)、1个运动能力丧失的突变株(H 029)、1个产胞外蛋白酶能力明显减弱的突变株(H 046),以及1个胞外蛋白酶缺失的突变株(H 045).     

植物青枯细菌胞外蛋白在致病中作用的研究

 用含有转座子Tn5的铜绿假单胞杆菌PAO1826(pMO75::Tn5,Kmr)诱变我国马铃薯青枯菌小种3号菌株PO41,获得胞外多糖正常产生的接合子6000多个,经SDS-PAGE电泳筛选出胞外蛋白减少1～9种的菌株21株。经测试其中20株为原养型菌株,1株为营养缺陷型菌株。这21株突变株在烟草叶片上呈现典型的过敏性反应。用茎部毛细管滴注法在马铃薯植株上进行致病力测试的结果表明,胞外蛋白发生减少的21株突变株中有20株致病力均不同程度下降,通过分析突变株胞外蛋白缺失种类与致病力强弱的关系,初步确定59.5ku、55ku和47ku的胞外蛋白在青枯菌致病过程中起着十分重要的作用。     

淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白酶活性及致病力的变化

【目的】明确食线虫真菌淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白酶活性和致病力的改变。【方法】测定淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白酶活性,及对南方根结线虫的致病力,分析它们与致病力的相关性。【结果】结果表明:14个淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶活力和蛋白酶活力由于T-DNA的插入均受到了不同程度的影响。对南方根结线虫卵的寄生率与原始菌株也存在分化,筛选获得了1株致病力增强的突变体BN-11和11株致病力明显下降的菌株;通过分析,这14个淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白质酶的活性与寄生率之间不呈正相关性。【结论】获得了淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白质酶的活性与致病力变化的证据,有助于淡紫拟青霉致病机制分析及致病相关基因的克隆。     

成团泛菌对玉米自交系PS056致病性基因yhfK的克隆

 【目的】通过克隆和鉴定成团泛菌(Pantoea agglomerans)的致病相关基因,阐明该种土壤习居细菌在玉米自交系PS056上引起细菌性干茎腐病的原因。【方法】利用转座子Tn5的随机插入突变特点,构建致病性菌株P. agglomerans XJ1突变体库;经对Tn5插入位点的侧翼扩增,确认突变体PA121的致病力相关基因;通过基因互补试验,证明yhfK与致病力的关系。【结果】通过对突变菌株的接种筛选,获得11个致病力丧失的突变体。Southern杂交和PCR扩增结果表明,Tn5在突变体PA121中为单拷贝插入,插入位点为细菌编码内膜蛋白的yhfK(Tn5 插入在yhfK的1 082 bp处)。将yhfK克隆到质粒pBBR1MCS上,并导入突变体PA121中进行互补,生物测定结果显示转化子完全恢复了正常的细菌生理功能,并能够在玉米自交系PS056上恢复致病力。RT-PCR试验证明,yhfK调控hrpA的转录。【结论】 成团泛菌XJ1中yhfK是调控其对植物致病性的基因之一,具有在玉米自交系PS056上引起细菌性干茎腐病的功能。     

水稻白叶枯病菌噻枯唑抗药突变体生物学性质研究

引起水稻白叶枯病的Xanthomonas oryzae在用药剂处理过的水稻上鉴别为抗噻枯唑的突变体。致病力和胞外酶活性测定结果表明，抗药性突 变体与野生敏感菌株没有明显差异，但抗药性突变体对离体稻叶的伤害作用及引起水稻体内脂质过氧化程度强于敏感菌株；胞外产物可以降低水稻白叶枯病菌对噻枯唑的敏感性，病菌产生抗药性与胞外产物关系密切；抗药突变体在无药平板上转移10代后，抗药水平明显下降，但致病力变化在不同的突变体间表现出较大差异，有的保持较强的致病力，有的则完全失去致病力。     

水稻立枯病原菌尖孢镰孢菌致病力降低T-DNA突变体的筛选与插入位点鉴定

为深入研究水稻立枯病原菌尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum Schelcht）致病分子机理,利用根癌农杆菌介导遗传转化技术构建尖孢镰孢菌突变体库,筛选致病力降低突变体,检测其T-DNA插入数量和位点。结果表明,691个突变体库构建成功,且突变体可稳定遗传后代。选取34个不同菌落形态变化突变体测定其致病力,筛选到6个致病力降低最严重突变体,分析其菌落形态、菌落生长速率和产孢量。与野生型相比,菌落形态存在差异,其中4个突变体B9、C36、D65、E17生长速率降低,6个突变体产孢数量均降低。通过Southern blot分析发现突变体B92有两个T-DNA插入,其余5个突变体为单个T-DNA插入,利用Hi TAIL-PCR确定6个突变体T-DNA插入位点。结果有助于更好理解尖孢镰孢菌与水稻之间分子相互作用,为进一步确定尖孢镰孢菌致病基因及其功能提供参考。     

西瓜噬酸菌pilN基因功能分析

为了分析菌毛组装蛋白家族基因对瓜类细菌性果斑病菌致病性的影响,以xjl12菌株为背景构建转座子(Tn5)插入的突变体文库,通过浸种处理和子叶注射接种方法筛选致病性相关突变体,通过两亲交配获得突变株,并对所得的突变体、野生型及互补等多个菌株进行致病性、过敏性反应、游动性等相关表型进行测定,用反转录PCR(qRT-PCR)方法验证xjl12和突变体中hrpG、hrcV、celA表达量的差异。结果表明:突变体文库中筛选得到1株致病力明显下降的突变体Δxj-7,经亚克隆鉴定为pilN基因,其功能主要与菌毛(pili)生物合成相关。两亲交配后所得突变菌株ΔpilNac相较于野生型,其致病性、游动性、胞外纤维素酶活性降低,同时丧失烟草过敏性反应。qRT-PCR试验结果显示,Ⅲ型分泌系统的主要调控基因以及纤维素酶生物合成基因在ΔpilNac中的转录水平明显下调。证明菌毛生物合成相关基因pilN对致病性有重要的调控作用。     

百脉根根瘤菌MAFF303099 Tn5转座子插入突变体库的构建及筛选

以百脉根根瘤菌MAFF303099为材料,利用转座子Tn5-sacB转座技术得到了约10 000个MAFF303099的转座接合子,构建随机插入突变体库进行保藏;同时建立了一套能从突变体库中快速筛选突变菌株的方法,且鉴定到共同结瘤基因nodB的突变体。结果表明:组成突变体库的接合子基因组中均有Tn5-sacB插入,三亲本转化效率为3.75×10~(-5);与野生型相比,MAFF303099 nodB的突变体在表型上不能使其宿主百脉根形成根瘤。     

水稻基腐病菌HrpX/HrpY在致病性中的功能分析

【目的】由Dickeya zeae引起的水稻基腐病是水稻上重要细菌病害之一,迄今对该病原细菌的致病性调控研究尚不完善。论文旨在分析水稻基腐病菌（Dickeya zeae）双组分调控系统HrpX/HrpY的序列特征,研究该系统在水稻基腐细菌中的功能作用以及与下游基因的调控关系。【方法】对HrpX/HrpY序列进行生物信息学分析,构建带有反向筛选标记基因scaB的自杀重组质粒pKNG-ΔhrpX和pKNG-ΔhrpY,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过2次等位基因同源重组筛选获得基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY;比较突变体与野生菌的生长速率、胞外酶活性、毒素活性、运动性、菌膜形成能力,以及对水稻的致病性和对烟草的过敏性反应（HR）;进一步提取细菌总RNA,采用实时荧光定量PCR研究HrpX/HrpY双组分系统对下游基因表达量的影响。【结果】水稻基腐病菌EC1基因组中,hrpX和hrpY均为单拷贝,hrpX编码区长1 473 bp,编码490个氨基酸,hrpY长642 bp,编码213个氨基酸,hrpX和hrpY两者之间相隔32 bp,具有相同的转录方向,在功能上具有相关性。其中,HrpX是一个结合在膜上的组氨酸蛋白激酶,HrpY是存在细胞质中的效应调节蛋白,HrpX/HrpY两者构成双组分系统,并对下游hrp基因的表达具有调控作用。进一步通过遗传操作手段,成功构建了基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY,表型测定结果表明,突变体ΔhrpX和ΔhrpY的运动性减弱、菌膜形成能力降低、对水稻种子萌发的抑制作用减弱,且降低了对水稻的致病力,但ΔhrpX和ΔhrpY的生长速率、胞外酶和毒素的活性变化不明显,也不影响其在烟草上的HR。实时荧光定量PCR结果显示,突变体菌株ΔhrpX和ΔhrpY相对野生菌EC1表达量明显下降的基因有hrpA、hrpF和hrpN,而对毒素合成基因zmsA表达量的差异不明显,HrpX/HrpY双组分系统对hrp基因簇中大部分下游基因都有正调控作用,且HrpY的调控作用更加明显。【结论】HrpX/HrpY是水稻基腐病细菌中的一个双组分系统,调节病原细菌的运动性、菌膜的形成和病菌的致病力,正向调控一些下游hrp基因的表达。     

水稻基腐病菌flhDC和fliA基因的功能

【目的】水稻细菌性基腐病(致病菌Dickeya zeae)是水稻重要细菌病害之一。细菌的鞭毛是重要的运动器官,迄今有关水稻基腐病菌的鞭毛系统、flh DC和fli A基因功能及其调控机理尚不清楚,明确这些鞭毛基因的功能,有利于进一步了解D.zeae的致病性综合调控网络、开发新型药物作用靶标以及制定病害防控策略。论文旨在明确D.zeae鞭毛系统中flh DC和fli A在致病性中的作用。【方法】以D.zeae野生型致病菌株EC1基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增待敲除的目标基因flh DC和fli A各自的上、下游片段,再以混合的上、下游片段为模板,扩增得到缺失flh DC和fli A的融合片段,双酶切纯化后连接到自杀性载体p KNG101上,构建带有反向筛选标记基因sac B的自杀重组质粒p KNG-Δflh DC和p KNG-ΔfliA,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过两次等位基因同源重组,PCR检测和测序验证,最终获得目标基因flh DC和fli A缺失突变体Δflh DC和ΔfliA;测定并比较突变体与野生菌的胞外酶活性、毒素活性、运动性、生物膜形成能力,以及对水稻的致病力和对烟草的过敏性反应(HR);进一步提取细菌总RNA,以16Sr DNA为内参来校正目标基因的表达量,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,比较野生菌和突变体Δflh DC和ΔfliA下游基因flh D、flh C、fli A和fli C的表达量差异。【结果】通过基因操作手段成功构建了基因缺失突变体Δflh DC和ΔfliA。表型测定结果显示,野生菌EC1的运动性和形成生物膜的能力很强,而基因缺失菌株Δflh DC和ΔfliA的运动性和形成生物膜的能力明显下降;野生菌株EC1对水稻种子萌发具有很强的抑制作用,而突变体Δflh DC和ΔfliA则显著降低了对水稻种子萌发的抑制作用;接种野生菌株EC1的水稻植株产生大面积褐色病斑,且腐烂程度严重,而接种突变体Δflh DC和ΔfliA的水稻植株只在接种的针刺部位周围出现水渍状褐色病斑,腐烂程度轻微,说明突变体菌株Δflh DC和ΔfliA显著降低了对水稻植株上的致病力。进一步的表型测定结果显示,突变体菌株Δflh DC和ΔfliA与野生菌EC1在产生胞外致病酶、毒素以及引起烟草HR能力等方面没有显著差异。q RT-PCR分析结果显示,在突变体菌株Δflh DC中,flh D和flh C不表达,fli A和fli C的表达量较野生菌明显下降;而在突变体ΔfliA中,flh D、flh C和fli A均不表达,fli C表达明显下降。【结论】调控细菌鞭毛基因表达的主调控因子flh DC操纵子,以及表达鞭毛特异性因子σ~(28)基因fli A,是细菌鞭毛系统基因簇的重要组分。flhDC和fliA显著影响D.zeae的运动性和生物膜形成能力,并显著影响水稻种子的萌发功能,在水稻基腐病菌的致病性中起重要作用。     

Xoryp_08180 of Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Encoding a Hypothetical Protein,is Regulated by HrpG and HrpX and Required for Full Virulence in Rice

Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xoc) causes a destructive bacterial leaf streak disease in rice. Some of the gene products annotated as hypothetical proteins in the genome of Xoc may contribute to its virulence in rice. A mutant, Mxoc1679, screened from our previous Tn5-tagged mutant library for Xoc strain RS105, showed reduced virulence in rice. In this mutant, a gene named as Xoryp_08180 was disrupted by Tn5 insertion. Xoryp_08180 encodes a 1 306-aa hypothetical protein which is highly conserved in Xanthomonas spp. Non-polar mutation of Xoryp_08180 in RS105 strain led to a significant reduction in bacterial virulence and growth in rice, a delayed hypersensitive response (HR) in non-host tobacco, and a decrease in extracellular protease activity. The deficiencies above were restored to wild-type level in the complementary strain by expressing Xoryp_08180 in trans. In addition, the expression of Xoryp_08180 was repressed in hrpG and hrpX mutants in planta but not in a nutrient-rich condition. These results suggested that Xoryp_08180 is a virulence factor required for extracellular protease production, HR induction and full virulence of Xoc.     

瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的构建及群体感应信号分子突变株的筛选

利用三亲杂交的方法将带卡那抗性的Mini-Tn5转座子随机插入瓜类细菌性果斑病菌xjl12基因组DNA中,构建插入不同位点的突变体文库,通过信号分子高效检测菌株JZAI,筛选群体感应信号分子失活突变株.挑取2株野生株和筛选出的4株突变株,进行Southern杂交,结果表明,转座子Mini-Tn5以单拷贝随机诱变瓜类细菌性果斑病菌获得成功;对筛出的4株突变株进行了致病性和烟草过敏反应测试,发现突变株明显降低了致病性,且2株突变株(5-17,2-57)在烟草上无过敏反应.瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的成功构建及筛选到不同突变位点的群体感应信号分子失活突变株,对从基因水平研究瓜类细菌性果斑病菌致病分子机理及群体感应相关基因奠定了基础.     

Exchangeability of Two hrp Gene Fragments from Xanthomonas oryzae pv.oryzae and pv.oryzicola for Hypersensitive Response on Tobacco and Pathogenicity on Rice

hrp- mutants were produced from strain JXOIII of Xanthomonas oryzae pv.oryzae (Xoo) and strain RS105 of X.o.pv.oryzicola (Xooc), respectively, by using diethyl sulfate (DES) as a mutagenic che-mical. All the hrp- mutants lost their pathogenicity on a susceptible host plant, rice (Shanyou63), and elicitation of the hypersensitive response (HR) on a nonhost plant, tobacco (NC89). Extracellular enzyme (amy-lase, pectate lyase, proteinase, cellulase and lipase) activities of all the hrp- mutants were similar to those of the corresponding wild type strains. The response of tobacco to cell-sonicated integrations of the wild type strains and the hrp- mutants demonstrated that there existed an HR eliciting substance which was heat-stable and sensitive to protease. No HR appeared on tobacco after infiltration of the lipopolysaccharide (LPS) of both the wild strains and hrp mutants into tobacco leaves. The ability of the Xooc hrp- mutants to induce HR on tobacco and cause streak disease on rice was restored by complementation with pUHRX245 from JXOIII genomic DNA library and by pUHRS138 from RS105 genomic DNA library, respectively. Subcloning of a 38.6-kb hrp fragment insert in pUHRX245 and a 39.3-kb insert in pUHRS138 revealed that a 3.3-kb SacⅠ fragment from pUHRX245 and a 4.5-kb BamHⅠ-KpnⅠ fragment from pUHRS138 were the minimal functional portions required for restoration of the ability of Xooc hrp- mutants to induce HR on tobacco and cause disease on rice. The disease symptom caused by the conjugant (M1005 plus 3.3-kb) on rice was similar to that caused by the wild type of Xooc. It suggests that the two fragments contain the same hrp gene(s) and are responsible reciprocally for HR induction on tobacco and pathogenicity on rice.     

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpXoo的克隆与序列分析

 用化学方法诱变水稻白叶枯病菌PXO99A 菌株 ,获得 6株hrp-突变体 ,此突变体除丧失在非寄主烟草上激发过敏反应和在感病寄主水稻上的致病能力外 ,有些缺乏激发烟草产生HR的信号物质 ,有些在胞内存在此信号物质 ,而不能泌至胞外。来自Xanthomonasoryzaepv .oryzaeJXOIII粘粒基因文库的hrp基因克隆pUHRX2 4 5 ,所携hrp基因片段大小为 36 .8kb。系列亚克隆 36 .8kbhrp基因片段及各亚克隆对hrp-突变体功能互补作用的结果显示 ,3.3kbSacI片段为最小酶切功能片段。序列测定和分析结果表明 ,3.3kbhrp片段含hrpX oo基因和含与热激蛋白 90家族有关的 2个开放阅读框hspORF1和hspORF2。HspORF1在蛋白质数据库中未发现序列蛋白。HspORF2与Hsp90 Xo的同源性达 99%。hrpXoo与黄单胞菌中已报道的hrpX基因有很高的同源性(90 %以上 )。在黄单胞菌中高度保守的编码α 螺旋 转 α 螺旋结构的 6 0 bp核苷酸序列 ,在交叉功能互补时是必需的。不含此结构的hrpXoo (1.1kb)片段 ,可使JXOIII的hrp-突变体在水稻上具致病性和在非寄主烟草上激发产生HR ,但不能使来自PXO99A 和RS10 5的hrp-突变体恢复在烟草上激发产生HR的功能。黄单胞菌中已知HrpX的同列比较显示 ,X .oryzae和X .campestris种间在 88、196和 2 4 7位点的氨基酸上有     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌,能引起十字花科作物发生黑腐病.本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变,获得17280株Tn5gusA5突变体,并从中筛选到一批致病缺陷突变体,采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位,发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORF1857内(未发表资料), 该ORF功能尚未见报道.序列分析表明,ORF1857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的wbpL基因演绎的编码产物具有33%的一致性和45%的相似性,并具有第4家族的糖基转移酶功能域,因此本文暂将ORF1857命名为wbxL基因.对 wbxL基因进行缺失,获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时,缺失突变体完全丧失致病性,一段PCR合成的包含wbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体,恢复缺失突变体的致病性.这证实wbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因.