鸭肠炎病毒us2基因转移载体的构建

以鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增得到us2全基因(包含s3、us3部分基因),将扩增产物克隆入pMD18-T载体,EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切连入pUC19载体,获得质粒pUC-us2.将完整的EGFP表达盒插入us2基因内BamH Ⅰ位点,得到转移载体质粒pUC-us2-EGFP.脂质体法将转移载体质粒pUC-us2-EGFP转染DEF细胞,观察到绿色荧光,说明EGFP基因获得表达.     

含绿色荧光蛋白基因的鸭肠炎病毒SD-01株US2基因缺失转移载体的构建

以鸭肠炎病毒(DEV)SD-01株DNA为模板,根据Gen Bank上已发表的基因序列设计一对引物,利用PCR技术扩增出US2全基因,将PCR产物连入pGM-T载体。用BamHI和EcoR V双酶切重组载体,使US2基因缺失约130bp,将含双loxP酶切位点的EGFP完整表达盒插入BamH I和EcoR V酶切位点之间,成功构建了以US2基因为重组臂的含EGFP基因的转移质粒载体pUS2-loxP-EGFP-loxP。     

表达绿色荧光蛋白为伪狂犬病病毒转移载体的构建及转移特性

对含伪狂犬病病毒（PRV）鄂A株gG全基因，PK，gD基因部分编码序列的质粒pUSK进行改造，肖除其中的EcoRI位点，将通过PCR扩增的增强绿色 荧光蛋白基因（EGFP）融合到gG启动子下游，构建了由gG启动子控制EGFP表达的PRV转移载体pgG^-1/EGFP^ ，该转移载体单独转染或同PVR基因组DNA共转梁IBRS－2细胞，结果单独转染时EGFP不能表达，共转梁时，6h就可在荧光显微镜下观测到明显的荧光。     

携带AIV HA基因鸭肠炎病毒转移载体的构建

为了获得携带禽流感病毒(AIV)HA基因鸭肠炎病毒转移载体,试验采用基因工程方法构建了带有CMV启动子、多克隆位点(MCS)及牛生长因子转录终止信号和加poly(A)信号(BGHpA)等真核表达元件的载体pET-3.1,将H5N1亚型禽流感病毒HA基因插入pET-3.1,再将携带真核表达元件的HA基因插入鸭肠炎病毒通用...     

表达红色荧光蛋白的重组鸭肠炎病毒的构建及鉴定

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV),又称为鸭瘟病毒,是一种只感染雁形目禽类的疱疹病毒。DEV具有基因组大、非必需基因多、能插入外源基因的容量大、遗传稳定等优点,其庞大而复杂的基因组为外源基因提供了诸多可插入位点,以DEV为载体,成功表达了禽流感病毒HA蛋白_^[1]、鸭病毒性肝炎病毒VP0蛋白_^[2]、鸭坦布苏病毒E基因_^[3]以及鹅细小病毒VP2蛋白_^[4]。构建重组DEV的重要一步是将报告基因插入到基因组中,目前常用的报告基因有绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)以及LacZ报告基团。本研究用RFP报告基团插入DEV UL2基因中,获得表达红色荧光的重组病毒,一步生长曲线表明,RFP对DEV的生长无影响;连续传代12代,RFP能够稳定表达,为DEV载体研究奠定基础。     

鸭肠炎病毒囊膜糖蛋白gE基因序列分析及真核表达载体的构建

为探索鸭肠炎病毒（DEV）囊膜糖蛋白gE基因的相关特性和功能,应用PCR扩增了DEV的gE基因,全长1473bp,编码490个氨基酸,其中1～22位氨基酸为信号肽。gE基因与国内分离强毒CHv株、国内疫苗株同源性均为100％,与德国分离强毒2085株同源性达到99％,显示其高度保守。将gE基因完整开放阅读框（gE）和去信号肽的gE基因（gE’）分别克隆至真核表达载体pCDNA3．1．获得重组质粒pCDNA3．1-gE、pCDNA3．1-gE,然后应用脂质体法转染vero细胞。RT—PCR扩增证实gE、gE’均在细胞内进行了转录,而间接免疫荧光试验证实只有gE’基因在veto细胞中获得了表达,h研究gE蛋白的功能及研制鸭瘟抗体检测试剂盒奠定了基础。     

鸭瘟病毒TK基因缺失转移表达载体的构建

根据Gen Bank发表的鸭瘟病毒基因组序列设计1对引物,扩增出含完整TK基因及其上下游序列的长约2.0 kb片段。利用该片段5'端和3'端部分序列作为左右同源臂,其内构建有Pcmv-MCS-BGH pA及同向Psv40-lac Z-SV40 pA表达盒,同时在lacZ基因表达盒两侧设计有loxP序列,从而获得鸭瘟病毒TK基因缺失转移表达载体p DTK-lacZ。将p DTK-lacZ转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,原位染色后镜下可见多处着染蓝色的细胞,结果表明本试验构建出适用于重组鸭瘟病毒制备平台的转移表达载体。     

含LacZ表达盒的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体的构建

根据GenBank已发表的鸭瘟病毒活疫苗C-KCE株基因组序列设计一对引物,扩增出含TK基因完整ORF的2.7 kb的片段,克隆至pMD18T simple载体。利用该片段内的两个酶切位点Xho I和EcoR V,切除TK基因内的244 bp,用T4 DNA聚合酶补平末端;pVAX1-LacZ用Nru I和Nar I双酶切,回收含LacZ表达盒的4.1 kb片段,通过平末端连接将LacZ表达盒插入到TK基因中,从而获得了转移载体pTK-LacZ,为构建重组鸭瘟病毒奠定了基础。     

绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测

拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）基因的真核表达载体 ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ,并观察其在 ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_3,以ＢａｍＨⅠ鉴定方向,以ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ将ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ转染至培养的ＭＤＣ Ｋ,经Ｇ４１８筛选ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ阳性克隆,荧光显微镜下观察。结果证实成功构建了含ＧＦＰ ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ,并成功转染ＭＤＣＫ,在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。 ＧＦＰ基因可在 ＭＤＣＫ细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记。     

口蹄疫病毒3ABC绿色荧光蛋白载体构建及表达

将O型口蹄疫病毒Akesu／58株适应细胞培养。用RT—PCR技术从适应细胞株中克隆了3ABC基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序鉴定。然后将目的基因与线性化的绿色荧光蛋白（PEGFPNl）栽体连接筛选阳性质粒命名为PEGFPN1-3ABC。将阳性质粒转入JM109大肠埃希茵增殖。提取PEGFPN1—3ABC质粒转染入BHK细胞,在荧光显微镜下直接观察表达结果。     

鸭瘟病毒转移质粒的构建

为了建立重组鸭瘟病毒技术,构建了鸭瘟病毒转移质粒。在对鸭瘟强毒和弱毒株TK基因进行测序分析后,将鸭瘟病毒TK-UL24DNA片段克隆于pUC18载体中,构建了质粒pTK;将PCR扩增的GFP真核表达盒插入pTK质粒的TK基因内部,获得转移载体质粒pTK-GFP。鸭瘟病毒TK-UL24测序分析表明鸭瘟强、弱毒株TK基因序列完全相同;转移载体携带Pcmv-GFP-SV40pA表达盒,测序验证其序列与源序列一致。pTK-GFP在脂质体介导下,转染鸭胚成纤维细胞和鸭肾细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。质粒转染细胞后,绿色荧光蛋白得到了有效的表达,为进一步开展重组鸭瘟病毒的研究和构建具有遗传标记的鸭瘟疫苗奠定了基础。     

反转录病毒载体RCASBP介导的EGFP基因在DF-1细胞中的表达

为建立反转录病毒载体RCASBP介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在DF-1细胞中的表达体系,本研究将PCR获得的EGFP基因插入反转录病毒载体RCASBP,构建重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP,之后将重组载体转染DF-1细胞;用基于禽白血病病毒(ALV) p27抗原的ELISA检测盲传至第4代的细胞上清,ELISA阳性结果说明重组病毒拯救成功;荧光显微镜观察发现80%以上DF-1细胞都有明显的绿色荧光信号,证明DF-1细胞表达绿色荧光蛋白;对DF-1细胞基因组进行特异性PCR检测,扩增出特异性条带说明重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP携带的EGFP基因整合到DF-1细胞的基因组中。本研究建立的RCASBP介导反转录病毒表达体系为研究ALV基因的结构和功能奠定了基础。     

Expression of Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) Gene Carried by a Lentiviral Vector RCASBP in DF-1 Cell

To construct a lentiviral vector RCASBP carrying the enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene which could be expressed stably in DF-1 cell,EGFP gene was amplified by PCR and then inserted into the lentiviral vector RCASBP after digested with the restriction endonuclease ClaⅠto construct recombinant lentiviral vector RCASBP-EGFP.The recombinant vector was transfected into DF-1 cells by Lipofectamine^TM 2000.Avian leukosis virus (ALV) p27 antigen ELISA test was performed after four passages of the transfected cells and the positive results of ELISA suggested the success rescue of the virus.The expression of EGFP was observed in more than 80 percentages of DF-1 cells under fluorescence microscope.The proviral genome PCR showed EGFP gene carried by the recombinant lentiviral vector RCASBP-EGFP had been integrated into the genome of DF-1 cells.The RCASBP lentiviral-mediated expression system provided a basis for study of the structure and function of ALV genes.     

表达增强型绿色荧光蛋白的报告猪瘟病毒C株的构建及在家兔中生物学特性评价

猪瘟兔化弱毒疫苗C株是我国自主研发的,用于预防猪瘟（CSF）的最好弱毒活疫苗。然而,现阶段的C株不具备标记功能,无法区分野毒感染与疫苗接种。本研究旨在将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码基因插入猪瘟病毒（CSFV）C株将其构建为报告病毒,为C株的基础研究提供病毒示踪工具,同时提供构建标记C株疫苗的方法。本研究中,笔者在CSFV C株中引入EGFP基因,分别构建了表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的报告CSFV rHCLV-EGFP,以及用CSFV强毒Shimen（SM）株N^pro基因替换C株N^pro基因后再引入EGFP基因的嵌合报告病毒rHCLV-N^pro（SM）-EGFP。通过猪瘟抗原ELISA检测,直接观察荧光及Western blot检测EGFP的蛋白表达等方法对拯救的病毒进行鉴定,并在细胞和家兔上评价这两株病毒的生物学特性。结果显示,两株报告病毒的抗原ELISA结果均为阳性;在感染rHCLV-EGFP的细胞中并未观察到绿色荧光也未检测到EGFP蛋白,但在感染rHCLV-N^pro（SM）-EGFP的细胞中观察到EGFP的绿色荧光并检测到EGFP蛋白;细胞试验结果表明,两株报告病毒与亲本病毒具有相似的生长特性且遗传稳定;家兔试验发现,rHCLV-N^pro（SM）-EGFP保留了C株的在家兔体内的生物学特性,但rHCLV-EGFP失去了C株诱导家兔定型热反应的能力。构建的嵌合报告病毒rHCLV-N^pro（SM）-EGFP可以作为C株的报告病毒进行应用：可以对病毒示踪,用于研究C株的复制过程、病毒与细胞的相互作用;同时,该嵌合报告病毒也具备发展为标记C株疫苗的潜力。     

利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白

为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培养细胞Pc-01后,用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-Δph/egfp+。将该重组病毒感染柞蚕蛹,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测EGFP在柞蚕蛹中的表达,结果显示:在柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV-Δph/egfp+后6 d,EG-FP就有明显的表达;感染后12～18 d,蛹体液中的EGFP含量保持较高水平,以EGFP标准样品定量分析EGFP在柞蚕蛹体液中的表达水平高于1 mg/mL;感染后30～39 d仍可以检测到蛹体液中EGFP的表达,而且蛋白稳定。研究结果表明,利用柞蚕核型多角体病毒作表达载体,可在柞蚕蛹中高效稳定地表达EGFP,并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。     

绿色荧光蛋白穿梭载体的构建及其在嗜酸乳杆菌中的应用

为深入研究嗜酸乳杆菌的作用机理,以温敏型穿梭载体pSET4s为基本骨架,将绿色荧光蛋白(GFP)和嗜酸乳杆菌上、下游同源臂插入该载体,构建GFP标记的穿梭表达载体pSET4s-P1-GFP-P2。利用电转化方法将穿梭表达载体pSET4s-P1-GFP-P2转化入嗜酸乳杆菌,通过抗性和温度双重筛选获得能稳定表达GFP的重组嗜酸乳杆菌,将Western blotting和荧光显微镜观察验证的重组菌命名为ΔMG6243(GFP)。利用荧光显微镜观察和平板计数的方法对重组菌进行遗传稳定性和生物学特性研究。结果显示,重组菌在蓝光激发下可见明显绿色荧光,连传10代仍可见明显荧光,与野生菌相比,其生长特性、酸碱盐耐受性均无显著差别。结果表明,本试验已成功构建稳定表达GFP基因的重组嗜酸乳杆菌,利用温敏型穿梭载体pSET4s实现了外源基因在嗜酸乳杆菌中非抗性、整合型表达,为嗜酸乳杆菌基因重组菌的构建奠定了基础,同时GFP的标记作用也为嗜酸乳杆菌在动物体内分布、定植规律和作用机理创造了可行的条件。