应用PCR技术检测饲料中的转基因成分

成功地从成品饲料中提取DNA，并采用PCR检测技术从中检出35S启动子，NOS终止子，EPSPS耐除草剂基因和CryLA(b)抗虫基因等转基因成分，同时通过扩增玉米（Zea mays)自身zein蛋白基因及大豆（Glycine max)自身lectin基因的引物和阴阳性对照，阴阳性质控，避免产生假阳性，假阴性结果。该方法已在口岸进口饲料转基因检测中得到初步应用。     

应用PCR技术检测饲料中的鱼源性成分

PCR方法在动物源性饲料检测中有很好的应用前景。为了有效检测反刍动物饲料中的鱼源性成分，降低疯牛病传播风险，本研究根据鱼线粒体1DNA 6S rRNA序列设计并筛选了鱼源性特异引物，使用Qiagen公司的组织DNA提取试剂盒提取核酸。PCR特异性检测结果表明，引物NC_Fish2480/2501F/ NC_Fish2565/2586R与牛、羊、猪、鸡成分无交叉反应；灵敏性检测结果表明，该引物可以检测到0.1%的鱼源性成分。该方法的建立为饲料中鱼源性成分的PCR检测提供了依据。     

进口饲料中牛、羊源成分的PCR同时检测方法

为防止疯牛病和痒病的传入，研究提供了一种利用Chelex-100快速提取动物基因组DNA的方法，并依据牛、羊线粒体基因的同源性序列片段，设计1对通用引物，通过PCR扩增，实现了对进境饲料中牛、羊源成分的同时检测。该方法简单、快捷，在口岸检疫部门中有一定的推广价值。     

蜂蜜中转基因成分的PCR检测

我国是蜂蜜生产大国,棉花是主要蜜源植物之一。近些年来,我国种植的棉花大多为转基因抗虫棉,棉花蜜中是否含有转基因成分,引起国内外广大消费者的密切关注。本文以抗虫棉种植地采取的棉花蜜为原料,采用改良CTAB法,在DNA提取过程中,用PBS缓冲液除去其中大部分的可溶性多糖,并提高CTAB提取缓冲液中NaCl浓度以去除残余多糖,从蜂蜜中成功提取出片段完整、纯度较高的DNA,DNA得率为486ng/mL,OD260/OD280为2.01,能够满足后续PCR定性检测的需求。从以转基因棉花为蜜源的蜂蜜中检测出外源DNA片段,建立了蜂蜜中转基因成分的PCR检测技术。本研究对转基因食品标识制度的完善、转基因食品监管、减少贸易摩擦以及保证消费者权益等具有重要意义。     

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测转基因成分的数据分析及其标准化研究

在利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q RT-PCR)检测转基因成分的含量时,数据分析的规范化与标准化对保证实验数据的准确性及实验室间数据的可比性具有重要意义。本研究以转基因玉米(Zea mays)NK603为研究材料,分析了分别以q RT-PCR中3次平行反应的单个Ct值和3次平行反应Ct值的平均值所绘制标准曲线的差异;分析了分别以盲样3次平行反应的Ct平均值和3次平行反应的拷贝数平均值(算术平均值或几何平均值)计算转基因成分含量的差异;并研究了结果准确性判定的方法。结果表明,标准曲线应基于单个Ct值;在计算转基因成分的含量时,Ct值应取算术平均值,拷贝数应取几何平均值;最后通过比较样品的测量结果与标准值之间的差异是否显著(UΔ>Δm,表明测量结果的平均值与样品的标准值无显著差别)来判断实验结果的可靠性。本研究为转基因产品检测中q RT-PCR实验数据处理的标准化提供了参考资料。     

用复合PCR方法检测6种转基因玉米中外源DNA的特异性

利用本实验室研制的植物DNA提取试剂盒，从玉米（Zea mays）种子中提取符合PCR检测要求的DNA。根据不同转基因玉米中重组DNA的结构，分别设计引物，可对Btl1、Event176、T25、MON810、GA21和NK603等6种转基因玉米进行特异性PCR检测。在此基础上建立了针对6种转基因玉米的特异性DNA片段和玉米内参照基因（zein）的复合PCR检测方法，能同时对7对引物进行扩增，通过产物的长度差异对不同的转基因玉米进行辨别，实现了在同一个PCR反应管中同时对6种不同转基因玉米的特异性检测。     

乳制品中水牛乳成分的实时荧光PCR检测技术

水牛奶制品因其良好的营养功效备受国内外消费者的青睐,而在国内外,乳制品掺假行为,却常有发生.我国作为水牛奶酪等乳制品的进口国,迫切需要一种准确的水牛成分的检测方法,来避免这种掺假行为对我国的进出口贸易造成损失.根据水牛Bubalus bubalus)线粒体细胞色素b(Cytb)基因的保守序列,设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针,建立了水牛乳成分的实时荧光PCR检测方法.运用实时荧光PCR方法对5种乳水牛样品和47种常见的非水牛动植物样品进行检测,5种水牛乳样品均产生荧光信号,其余非水牛样品均不产生荧光信号,表明该检测方法具有特异性.该检测方法的重量检测灵敏度为0.01％水牛奶(W/W),DNA浓度检测灵敏度为0.001 ng/μL水牛DNA.对市售的水牛奶制品进行实际样品检测,结果表明,该方法能很好地检出水牛乳成分.本研究表明,该方法具有特异性好、灵敏度高的优点,可作为乳制品中水牛乳成分鉴别检测的有效方法.     

饲料中喹乙醇检测方法研究

本文建立了饲料中喹乙醇的高效液相色谱检测方法。样品用甲醇—水(体积比5∶95)提取,以10%甲醇溶液为流动相(体积比10∶90),AgilentC18色谱柱分离,二极管阵列检测器定量检测和定性筛查(检测波长260nm,光谱扫描为200～400nm);喹乙醇的线性范围为0.2～50.0μg/mL,r=0.9999;方法检测限为1.0mg/kg,定量限为2.0mg/kg。样品中喹乙醇加标回收率为99.8%～112.3%。     

利用实时荧光PCR进行植原体通用检测

本实验意在研究一种能够应用于植原体初筛,并且不易污染,易操作耗时短的通用方法.比较了已报道TaqMan实时荧光PCR与目前最常用巢式PCR在植原体通用检测中的应用.利用12种植原体感染植株及9种健康植物DNA测试了实时荧光PCR的特异性及通用性.所有植原体材料均获得强的荧光信号,为阳性结果,而健康植物DNA及空白对照均为阴性结果.实验结果证明该实时荧光PCR应用于植原体通用检测具有良好的特异性,相对灵敏度比巢式PCR高10倍,耗时短,操作方便,有效避免了PCR产物污染.实时荧光PCR为植原体病害的口岸检疫、田间监测及大量样品的通用检测提供了良好的技术支撑,是一种可能代替目前最常用巢式PCR的方法.     

多重PCR筛查检测进口转基因玉米

为获得进口转基因玉米筛查检测策略,并根据策略建立多重PCR方法,对15个进口转基因玉米分子特征进行分析。结果表明,将P-Ca MV 35S、T-NOS等2个基因组合作为检测策略可全部检出15个进口转基因玉米至少1次;将P-Ca MV 35S、P-ract1、T-NOS、bar、pat、PMI等6个基因组合作为检测策略,除MON810检出1次外,其他每个转化体可检出至少2次。同时,利用获得的筛查检测策略建立多重PCR体系,对2个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol·L-1)配比为0.2∶0.2;对6个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为60℃,引物终浓度配比为0.2∶0.1∶0.1∶0.1∶0.1∶0.05。采用已知样品对多重PCR体系进行验证,图谱显示与转化体分子特征完全一致。该研究结果将为进口转基因玉米筛查检测提供参考。     

利用PCR技术检测异性孪生不育母牛

根据异性孪生不育母牛性染色体嵌合体是XX/XY,而正常母牛性染色体型为XX这一现象,研究开发了一种基于PCR技术检测异性孪生不育母牛的方法:利用牛1.715微卫星做内标基因检测样品DNA的质量,在此基础上,检测被检母牛体内是否存在Y染色体特异的Sry基因,如果检测出Sry基因,则判定被检测牛是异性孪生不育母牛,如果没有检测出Sry基因,则判定被检测牛不是异性孪生不育母牛。利用该项技术,可以快速、准确地检测异性孪生不育母牛。     

反刍动物饲料中乳源性成分与牛羊肉骨粉的区分

利用奶粉的溶解性,通过水和0.5%次氯酸钠溶液洗涤混有乳源性成分和牛、羊肉骨粉的饲料样品,去除饲料中的乳粉成分后,再使用16S rDNA PCR方法进行动物源性检测。结果表明,实验所建立的方法能够完全区分饲料中的乳粉与肉骨粉。当乳粉含量分别为25%、50%和75%时,混合饲料中牛、羊肉骨粉的检出限分别为2%、0.5%和0.1%。此方法操作简单,容易掌握,可用于鉴别反刍动物饲料中非乳源性成分的牛、羊源性成分。     

昆明地区碳酸盐岩发育红土载磁矿物的提取与鉴定

利用重液分离工艺对昆明地区磁化率最高的碳酸盐岩发育的红土进行载磁矿物的分离提取,并对提取出的样品进行X射线衍射(XRD)鉴定,结果显示碳酸盐岩发育红土的主要载磁矿物为磁赤铁矿(γ-Fe2O3)、赤铁矿(α-Fe2O3)和针铁矿(α-FeOOH),它们占总载磁矿物的半定量比例分别为30％、37％和33％,这些测定结果大体...     

实时荧光定量聚合酶链式反应快速鉴定三种鳕鱼

为鉴定常见的3种鳕科鳕鱼(大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼和黑线鳕),选用16S rDNA基因设计区分鳕科和非鳕科鱼类的引物,选用线粒体Cytb基因设计区分3种鳕鱼的物种特异性引物,建立实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)体系,对其进行物种分析。结果表明,16S rDNA qPCR体系及3种鳕鱼品种特异性qPCR体系均具有良好的性能,结合标准曲线,可以对单一或混合样品中的目标鳕鱼进行定量检测。在模拟混合样品中目标鳕鱼的相对检测灵敏度可达0.01%。通过对13种市售样品的检测,本研究设计的qPCR体系可检测出原料及深加工产品中的鳕鱼成分。综上,所建立的qPCR体系具有很强的实用性,能满足日常检测的要求,并有望作为未来鳕鱼市场管理的检测方法。     

绵羊高繁殖力主效基因的研究及应用

繁殖性能是绵羊的重要经济性状。本文介绍了绵羊高繁殖力主效基因骨形态发生蛋白受体IB、骨形态发生蛋白15、生长分化因子9及其与绵羊高繁殖性能之间的关系以及高繁殖力主效基因FecB和FecXI的应用。     

模拟酸雨淋溶下不同母质发育雏形土矿物风化中的盐基离子与硅计量关系

土壤矿物风化过程中释放的盐基离子(BC)与硅(Si)的比值(BC︰Si)是定量评估土壤矿物风化对土壤酸化过程缓冲作用的基础,是准确估算当前环境下土壤酸化速率的依据。本研究以云母片岩、片麻岩和安山岩3种母质发育的湿润雏形土为研究对象,测定了其土壤物理、化学和矿物学性质。通过洗脱实验除去土壤交换性盐基以消除土壤胶体吸附的交换性盐基离子对矿物风化计量关系的影响,再利用模拟酸雨淋溶实验,采用Batch方法获取3种不同母质发育土壤的盐基离子和硅的释放量,进一步估算BC︰Si值。结果表明,由于母岩不同,土壤黏粒、pH、有机质、交换性盐基(K⁺、Na⁺、Ca²⁺和Mg²⁺)、阳离子交换量(CEC)和土壤矿物含量存在差异。在模拟酸雨淋溶实验条件下,未洗脱盐基土壤的BC︰Si值为洗脱盐基土壤的3倍以上,因此只有洗脱土壤交换性盐基才能获得来自风化过程的BC︰Si值。同一母质发育土壤的腐殖质表层(Ah)BC︰Si最小,母质层(C)最大。不同母质发育土壤的BC︰Si值表现为：片麻岩>云母片岩>安山岩,土壤中斜长...     

牛肉中疯牛病特殊风险物质荧光RT-PCR检测方法的建立

本研究建立了检测牛肉中疯牛病特殊风险物质（主要是中枢神经组织）标记物GFAP mRNA的荧光RT-PCR检测技术。试验结果表明：该技术具有良好的种属特异性和组织特异性，只能从牛源和羊源的中枢神经组织中检测到GFAP，猪源和禽源检测结果为阴性，而且只有脑和脊髓等中枢神经组织产生阳性反应，其他内脏组织以及不同部位牛肉检测结果均为阴性；敏感性检测结果表明，该方法最低检测限达到0.001%以下；稳定性试验结果表明，100°C 加热处理30min对检测结果无明显影响，中枢神经组织在30°C以上室温可以稳定存放4天， 在4°C可以稳定冷藏2周，检测结果仍然为阳性。该结果显示，所建立的荧光RT-PCR技术用于牛肉中疯牛病特殊风险物质的检测具有特异性强、敏感性高、稳定性好及快速方便等优点，适合于在日常检测工作中推广使用。     

利用InDel标记鉴定水稻育种材料的籼粳属性

准确高效鉴定水稻材料的籼粳属性对于开展水稻籼粳亚种间杂种优势利用有着重要意义.利用19对基于籼稻(9311)和粳稻(日本晴)全基因组DNA序列比对获得的差异片段而设计的特异插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)引物,对48份育种上常用的籼稻、粳稻和中间型材料(品种)进行了InDel 标记的籼粳属性分析,利用DNA样品在这19对InDel位点上的籼型或粳型基因频率,结合聚类分析和主成分分析,确定了这些材料的籼粳属性,通过比对程氏指数法的籼粳鉴定结果检验了InDel分子标记法在水稻籼粳属性鉴定上的有效性.结果表明,InDel分子标记法与传统的程氏指数法的总体吻合率为89.58％,在典型籼稻或典型粳稻材料上两者的吻合率为100％;在具有复杂遗传背景的中间型材料上,InDel分子标记法比程氏指数法具有更高的准确性.因此,InDel分子标记法是真正鉴定籼粳的特异方法,比传统方法具有更高的灵敏性和准确度,可以用于籼粳属性鉴定及遗传分化研究.