山东省枣疯病植原体的鉴定及分子变异分析

 本研究对山东省11个地区的枣疯病样品进行了鉴定和分子变异分析。以样品总DNA为模板,经扩增和序列测定,分别得到16S rRNA (1 432 bp)、核糖体蛋白基因rp (1 196 bp)、转运蛋白基因secA (836 bp) 和secY (1 421 bp) 的序列,secA基因序列是首次从枣疯病植原体中扩增获得。对获得的序列与NCBI数据库中相关植原体序列进行聚类和核苷酸变异分析,结果显示山东省枣疯病植原体属于16SrⅤ-B、rpⅤ-C、secYⅤ-C亚组,相对于16S rRNA基因,rp,secA和secY变异更大,非同义突变更多,更利于对国内不同来源的枣疯病植原体的精细系统进化分析。     

臭矢菜丛枝病植原体的分子鉴定研究

 本实验采用DAPI荧光显微镜、PCR、克隆和测序等技术,对海南臭矢菜丛枝病样进行了检测和鉴定。以染病臭矢菜总DNA为模板应用3对植原体特异性引物进行PCR扩增,获得PCR产物为16S rDNA(1 430 bp)、16S-23S rDNA(358bp)、rp DNA(1 294 bp)。应用DNA回收试剂盒获得了3个PCR扩增片断的纯化产物,并克隆到DH5α大肠杆菌中测序。应用DNAMAN和MEGA软件对获得的序列与NCBI数据库中植原体序列进行同源性分析和构建系统发育树。结果显示臭矢菜丛枝病植原体与花生丛枝病植原体序列同源性最高,16S rDNA的序列同源性为99.9%,16S-23S rDNA高达100%,rp为99.7%,因而将臭矢菜丛枝病植原体归为花生丛枝组(16SrⅡ),根据16S rDNA的RFLP分析,将其归为16SrⅡ-A亚组。     

广东花生丛枝病植原体的分子鉴定

2020年在广东省湛江市遂溪县田间发现表现明显丛枝?小叶, 类似植原体感染症状的花生病株?本研究利用分子生物学技术对其病原进行鉴定?以花生病叶的总DNA为模板, 利用植原体16S rRNA和SecY基因通用引物进行PCR扩增, 获得广东花生丛枝病植原体(PnWB-GDSX-2020)16S rRNA基因片段(1 430 bp, GenBank登录号为MZ427281)和SecY基因片段(1 709 bp, GenBank登录号为MZ437794)?序列一致性和系统进化分析显示, PnWB-GDSX-2020的16S rRNA序列与16SrⅡ-A?16SrⅡ-D和16SrⅡ-V亚组植原体一致性最高, 亲缘关系最近; 进一步利用iPhyClassifier对16S rRNA序列进行在线虚拟RFLP分析, 结果显示, PnWB-GDSX-2020的虚拟RFLP 图谱与16SrⅡ-V亚组的参照株系‘Praxelis clematidea’ phyllody phytoplasma (GenBank登录号:KY568717) 酶切图谱一致, 相似系数为1.00?因此, PnWB-GDSX-2020属于16SrⅡ-V亚组成员?所获得的PnWB-GDSX-2020 Sec Y基因序列与花生丛枝植原体的一致性最高, 亲缘关系最近?本文确定了广东花生丛枝病相关植原体的分类地位, 为当地病害诊断?检测以及防控提供科学依据?     

几种植物类菌原体(MLOs)的分子检测及其遗传相关性比较

 以密西根翠菊黄化病MLO 16S rDNA序列为依据,参照有关引物序列,改进合成寡核苷酸R₁和L₁作为引物对,应用聚合酶链式反应(PCR)技术,以甘薯丛枝病(SPWB),泡桐丛枝病(PWB),枣疯病(JWB)和枣疯病长春花(JPWB)罹病植株中提取的DNA为模板,扩增出了1.2 Kb的MLO 16S rDNA片段。该方法所需罹病植株的总DNA量分别为:甘薯丛枝病2×10^-2 ng/μl,泡桐丛枝病0.4×10^-2 ng/μl,枣疯病0.8×10^-2 ng/μl,感染枣疯病的长春花0.3×10^-3 ng/μl。对1.2kb 16S rDNA进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析,首次确证枣疯病的罹病植株中存在枣疯病MLO和泡桐丛枝病MLO混合侵染的现象。     

广东番茄巨芽病植原体的分子鉴定

2022年, 对在广东省湛江市廉江市田间发现的疑似番茄巨芽病病株, 利用分子生物学方法对其相关植原体进行了鉴定。以番茄病株叶片总DNA为模板, 利用植原体16S rRNA基因通用引物R16mF2/R16mR1进行PCR扩增, 获得了广东番茄巨芽病植原体(TBB-GD-2022)16S rRNA基因片段(1 430 bp, GenBank登录号为ON102780)。16S rRNA基因序列相似性分析显示, TBB-GD-2022与16SrⅡ组植原体菌株的相似性较高, 为96.82%~100%, 其中与隶属于16SrⅡ-V亚组的6个植原体株系相似性为100%。系统进化分析显示, TBB-GD-2022与16SrⅡ组各植原体株系聚类在一个大分支, 并与16SrⅡ-V亚组成员聚类在一个小分支, 亲缘关系较近。16S rRNA 基因相似系数分析表明, TBB-GD-2022与16SrⅡ-V亚组的参照株系‘Praxelis clematidea’ phyllody phytoplasma (GenBank登录号:KY568717) 的相似系数为1.00。上述研究结果表明, 广东番茄巨芽病植原体隶属16SrⅡ-V亚组成员。本文首次报道在广东发现番茄巨芽病, 通过其16S rRNA序列分析进一步确定了其相关植原体的分类地位, 为该病害的防控提供了科学依据。     

海南省木豆丛枝病植原体的分子检测及鉴定

 利用植原体通用引物R16mF2/R16mR1和rp (Ⅱ) F1/rp (Ⅱ) R1对海南木豆丛枝病植原体16S rDNA和部分核糖体蛋白(ribosomal protein,rp)基因序列进行PCR扩增、克隆和测序。获得海南木豆丛枝病植原体16S rDNA基因片段为1430bp,rp基因片段为1170bp。核苷酸同源性比较和系统进化树构建表明,引起海南木豆丛枝病的植原体应属于16SrⅡ组中的亚组ⅲ。本研究首次从分子水平确定了引起我国海南木豆丛枝病的病原物为植原体,明确了其分类地位,为该病害流行学研究和防治提供了理论依据。     

竹小叶病植原体的分子鉴定

 2008年在杨凌采集到具有典型植原体侵染症状的菲白竹,应用植原体16S rRNA基因的通用引物对R16mF2／R16mR1和R16F2n／R16R2对其进行检测,巢式PCR得到约1.2 kb的特异性片段。对扩增片段进行测序并进行系统进化树分析,结果表明,该病原属于翠菊黄化组(Candidatus Phytoplasma asteris),与该组成员同源性均在98%以上。随后用16Sr Ⅰ组和Ⅴ组特异引物对R16（Ⅰ）F1／R16（Ⅰ）R1和R16（Ⅴ）F1／R16（Ⅴ）R1也证明其属于翠菊黄化组,RFLP 分析表明该植原体属于16SrⅠ-B亚组。植原体侵染菲白竹在中国属首次报道。     

菊花绿变病植原体在中国的发生及分子鉴定

对内蒙古农业大学校园内表现花器绿变症状的菊花样品进行采集和DNA提取,应用植原体16S rRNA基因和rp基因的引物进行巢式PCR扩增,从感病样品中分别扩增得到了长度均约为1.2 kb的片段。序列一致性分析表明,菊花绿变植原体16S rRNA基因与翠菊黄化植原体匈牙利风信子株系(GenBank登录号MN080271)、印度玉米株系(KY565571)、印度繁缕株系(KC623537)和印度马铃薯株系(KC312703)的核酸一致性最高,为99.9%,rp基因序列与翠菊黄化植原体立陶宛洋葱株系(GU228514)的核酸一致性最高,为99.8%。基于16S rRNA基因和rp基因构建系统进化树时发现,菊花绿变植原体均与16SrI-B亚组成员聚为一起。16S rRNA基因相似性系数分析表明,菊花绿变植原体与洋葱黄化植原体(AP006628)的相似性系数最高为1.00,洋葱黄化植原体(AP006628)在分类上属于16SrI-B亚组。因此,我们可以确定该菊花绿变植原体属于16SrI-B亚组。这是我国首次报道菊花绿变病的发生。     

榆树黄化病植原体的分子检测与鉴定

 利用植原体16SrRNA基因的通用引物R16rrLF2/R16mR1和R16F2n/R16R2对山东泰山上发生的榆树(Ulmus parvifolia)黄化病感病植株总DNA进行巢式PCR扩增,得到了约1.2kb的特异性片段,从分子水平证实了榆树黄化病的病原(EY-China)为植原体。将扩增到的片段测序,并进行一致性和系统进化树分析。结果表明,该分离物属于植原体榆树黄化组(Candidatus Phytoplasma ulmi),与该组成员16SrRNA序列的一致性均在98.2%以上,其中与16SrV-B亚组中的纸桑丛枝(Paper mulberry wiches'-broom)和枣疯病(Jujube witches'-broom)植原体一致性最高,达到99.4%,在系统进化树中与该亚组成员聚类到同一个分支,说明该分离物属于植原体16SrV-B亚组。本研究首次对在中国引致榆树黄化病的植原体进行了分子检测,并通过核酸序列分析将其鉴定到亚组水平。     

两种林木植原体病害的分子鉴定

近年来, 林木植原体病害发生日趋严重, 对我国林业经济和生态造成了很大损失。2021年-2022年, 在山西沙棘主产区的沙棘上和北京冬奥园区的油松上分别出现了典型的植原体病害症状;沙棘叶片皱缩, 呈小叶状;油松过度分枝生长且出现球状结构等。本研究通过荧光显微观察, 16S rRNA和tuf基因序列分析, 并结合虚拟限制性片段长度多态性分析证实了这两种病害均由植原体引起。基于16S rRNA的系统进化分析显示:引起沙棘叶片皱缩的植原体与泡桐丛枝植原体(Paulownia witches’-broom phytoplasma, OP107515.1)的相似性最高(99.92%), 引起油松丛枝的植原体与狗尾草丛枝植原体株系(Setaria viridis witches’-broom phytoplasma, FJ263625.1)的相似性最高(99.52%);基于tuf基因的系统发育树显示, 二者同属于16SrⅠ组D亚组(16SrⅠ-D)。本研究首次明确了沙棘叶片皱缩病和油松丛枝病相关植原体的分类地位, 为这两种植原体病害的准确诊断、快速检测及其防治提供了基础资料。     

Electron microscopy and molecular identification of phytoplasmas associated with strawberry green petals in the Czech Republic

The presence of phytoplasma inFragaria ananassa x Duch cv Senga Sengana showing strawberry green petals symptoms was observed by electron microscopy of phloem tissue. No phytoplasmas were found in asymptomatic strawberry plants used as controls. Nucleic acids extracted from these plants were used in nested-PCR assays with primers amplifying 16S rRNA sequences specifie for phytoplasmas. Bands of 1.2 kb were obtained and the subsequent nested-PCR with specific primers and RFLP analyses allowed to classify the detected phytoplasmas in the aster yellows group (16SrI). They belonged to the subgroup I-C of which type strain is clover phyllody phytoplasma.     

江西柑橘主产区柑橘衰退病毒分离株组群分析

为检测江西柑橘主产区柑橘衰退病毒分离株组群的构成情况,运用限制性片段长度多态性(RFLP)对收集自江西柑橘14个主产区果园的CTV分离株进行分析。发现209份样品的CP/HinfⅠ酶切结果中182份样品表现出单一CP/HinfⅠRFLP谱型,占鉴定样品总数的87.1%,其中以CP/HinfⅠRFLP第3和第1组群的分离株构成为主,分别占样品总数的55.5%和26.8%;混合CP/HinfⅠRFLP组群样品占12.9%。本次检测中发现有1个分离株为第4组群,5个分离株为第5组群,可能为潜在的弱毒分离株。本次试验中检测的江西柑橘样品以CTV单一组群感染为主。     

丁香卷叶病植原体的分子鉴定

 通过透射电子显微镜,在表现卷叶、褪绿症状的丁香(Syringa oblata)样品的叶脉韧皮部筛管细胞内观察到大量植原体粒子。应用植原体16S rRNA基因通用引物对P1/P7和R16F2n/R16R2对表症丁香植株总DNA进行巢式PCR扩增,得到了约1.2 kb的目标片段,通过对扩增片段进行测序、系统发育分析和同源性分析,结果表明,该片段长度为1 246 bp,在系统发育进化树上与翠菊黄化组（Candidatus Phytoplasma asteris）成员是聚集在一起的,与该组成员同源性均在98%以上。用16Sr RNAⅠ组和Ⅴ组特异引物确定了该病害非混合侵染所致,相似性系数和RFLP分析表明该植原体属于16SrⅠ B亚组。这是国内关于翠菊黄化组植原体在丁香上感染的首次报道。     

Molecular characterization ofPseudomonas syringae pv.tomato isolates from Tanzania

Bacterial speck caused byPseudomonas syringae pv.tomato is an emerging disease of tomato in Tanzania. Following reports of outbreaks of the disease in many locations in Tanzania, 56 isolates ofP. syringae pv.tomato were collected from four tomato- producing areas and characterized using pathogenicity assays on tomato, carbon source utilization by the Biolog Microplate system, polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. All theP. syringae pv.tomato isolates produced bacterial speck symptoms on susceptible tomato (cv. ‘Tanya’) seedlings. Metabolic fingerprinting profiles revealed diversity among the isolates, forming several clusters. Some geographic differentiation was observed in principal component analysis, with isolates from Arusha region being more diverse than those from Iringa and Morogoro regions. The Biolog system was efficient in the identification of the isolates to the species level, as 53 of the 56 (94.6%) isolates ofP. syringae pv.tomato were identified asPseudomonas syringae. However, only 23 isolates out of the 56 (41.1%) were identified asPseudomonas syringae pv.tomato. The results of this work indicate the existence ofP. syringae pv.tomato isolates in Tanzania that differ significantly from those used to create the Biolog database. RFLP analysis showed that the isolates were highly conserved in theirhrpZ gene. The low level of genomic diversity within the pathogen in Tanzania shows that there is a possibility to use resistant tomato varieties as part of an effective integrated bacterial speck management plan. http://www.phytoparasitica.org posting August 8, 2008.     

Association of aster yellows subgroup 16SrI-B phytoplasmas with a disease of Rehmannia glutinosa var. purpurea

A new phytoplasma disease of Rehmannia glutinosa var. purpurea was observed in the Czech Republic in 1998. Infected plants showing severely proliferating shoots, leaves reduced in size with vein clearing and chlorosis, shortened internodes and virescent petals died in advanced stages of the disease. Electron microscopy examination of the ultra-thin sections revealed the presence of numerous polymorphic bodies in phloem tissue of leaf midribs and petioles. The disease was successfully transmitted from infected plant via a dodder bridge into periwinkle ( Catharanthus roseus ). The phytoplasma aetiology of this disease was further confirmed by polymerase chain reaction (PCR) using universal primers R16F2/R16R2. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of amplification products indicated the presence of aster yellows related phytoplasmas (16SrI-B) in naturally infected samples of R. glutinosa var . purpurea and in symptomatic periwinkle after dodder transmission of the agent. A comparison of the amplified sequence with 17 sequences available in the GenBank confirmed the classification of the phytoplasma in the subgroup 16SrI-B. This is the first report of natural occurrence of phytoplasma-associated disease in R. glutinosa var. purpurea.     

用滚环扩增技术检测双生病毒

 本文报道了利用滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)放大双生病毒的靶核酸信号,进而利用限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)检测不同类型双生病毒的新技术体系。研究结果表明,利用RCA-RFLP对于已知的单组份和双组份以及带有卫星的菜豆金色花叶病毒属病毒都能够有效检测,对采自浙江杭州地区的田间样品进行RCA-RFLP检测的结果与利用简并引物PA和PB进行PCR扩增的结果相吻合。相比传统的PCR检测方法,用RCA-RFLP体系检测双生病毒灵敏性更高,操作更简便。