水稻白叶枯病抗性基因的鉴定、定位、克隆与育种应用

水稻白叶枯病是由黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae Xoo)引起的细菌性病害,发掘、鉴定和利用新抗源是控制水稻白叶枯病的有效途径.白叶枯抗性基因定位和克隆,使分子标记辅助选择和转基因技术在白叶枯抗病育种中发挥了重大作用,也使人们在分子水平对白叶枯病抗性机制有了深刻认识.文章综述了白叶枯病抗性基因定位,克隆以及在育种方面的应用,并对如何利用抗病育种减轻白叶枯病的危害提出了几点建议.     

白叶枯病抗病基因Xa21与Xa23的聚合育种研究

由黄单胞细菌引起的水稻白叶枯病是水稻的三大病害之一,而广谱持久抗病品种的培育是控制该病害最经济有效的措施。本研究利用Xa21的优化功能标记与苗期白叶枯病抗病鉴定,将目前抗谱最广、抗性最强的两个位于同一染色体上的显性基因Xa21与Xa23聚合到杂交稻重要恢复系明恢86,从2138株F2分离后代里,最终得到9株Xa21及Xa23基因的聚合植株。本研究可为紧密连锁的基因聚合提供了新的思路。     

新品种绿珍8072和白香占的抗白叶枯病遗传分析及其基因检测

白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)是水稻最严重的细菌性病害,抗病品种的培育利用是控制该病最经济有效的措施。本研究对新选育的抗白叶枯病品种绿珍8072和白香占抗性基因鉴定及遗传分析,以供生产应用参考。以绿珍8072和感病籼稻品种金刚30杂交,对亲本、F1和F2代接种广东白叶枯病强致病性菌系V型菌GD6027进行表型抗性鉴定,并利用与Xa7紧密连锁的微卫星标记对亲本和F2代个体进行了多态性和连锁分析,确定绿珍8072含有Xa7等位抗性基因并独立遗传;用同样的方法鉴定了白香占的抗性基因及其遗传方式,结果表明,白香占抗白叶枯病基因与xa5基因相关,但其F2代抗感病表现型和基因型分离比,不符合孟德尔隐性单基因遗传抗感(1:3)的分离比定律,存在偏分离现象。     

高EGCG含量的特异茶树种质资源的筛选与研究

EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯, Epigallocatechin gallate）是茶叶具有抗癌功效的核心成分^[1~3]，是决定茶叶饮料品质好坏的关键因子之一^[4]，是茶多酚具有生理活性和广阔用途的最关键的核心成分^[5~7]。EGCG在不同茶树品种新梢的含量一般为9%～13%，前人对EGCG的研究主要集中于抗癌、抗氧化、抗病毒等功能性方面^[8~10]。而茶树EGCG的遗传规律、资源筛选等方面研究在国内外均未见报道。我国茶树种质资源极为丰富，居世界之首^[11]，前人已对茶树种质资源作了深入研究，并在品种早期鉴定、分子标记、遗传多样性、农艺性状、生物化学、细胞学、解剖学、形态学、制茶学、孢粉学、发酵学及抗性（抗寒、抗病虫）等领域取得长足进展^[12～19]。若能从我国茶树种质资源中筛选出高EGCG含量（>13%）的品种或株系，一方面，可作为茶树品质遗传改良的重要资源；另一方面，可应用于生产，从茶树鲜叶中直接大量提取EGCG。因此，高EGCG含量的特异茶树种质资源研究，对于EGCG的工业化生产、茶树新品种选育、提高茶树鲜叶或干茶的品质等方面都具有重要意义。本试验旨在筛选高EGCG含量的茶树特异资源。     

水稻早世代稳定株系的农艺性状分析

育种实践表明，水稻品种间和亚种间杂交后代农艺性状发生疯狂分离，纯合个体的出现一般需经7~10代，5~8年^[1,2]。采用花培^[3,4]和远缘杂交染色体消除技术^[5,6]虽已应用于缩短作物育种时间，但仍耗时耗力。在作物如小麦、大麦、花生、水稻 ^[8~13]等育种实践中，偶尔会遇到杂种F2不分离的现象。吴先军等^[11]提出了水稻早世代稳定现象的概念，即水稻杂交后代F3以前出现农艺性状整齐一致、以后世代不分离的遗传现象。由于水稻早世代稳定现象在育种中具有巨大的应用潜力，对其遗传机制和育种应用进行深入而系统的研究具有重大的理论探讨价值和现实意义。     

水稻转录因子WRKY68在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用

白叶枯病是一种严重影响水稻产量的细菌性病害。Xa21是第一个克隆的抗白叶枯病基因,具有广谱抗性,在水稻抗病育种中被广泛应用。转录因子的鉴定对解析Xa21介导的水稻抗白叶枯病分子机制具有重要意义。本研究构建了Xa21背景下的WRKY68-RNAi转基因水稻。与受体材料4021相比,转基因水稻中WRKY68蛋白质丰度下调,接种白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)后抗病性下降,证明WRKY68基因在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用。此外,转基因受体材料4021和感病对照TP309接种后不同时期和部位叶片中WRKY68的蛋白质丰度没有显著差异,表明WRKY68蛋白质的表达不受抗病基因Xa21和病原物Xoo诱导,推测其功能主要是调控下游基因的表达。WRKY68-RNAi转基因水稻接种后, PR1A、PR5、PR10A、PR-pha和PAL1等病程相关蛋白质表达丰度发生变化,表明相关基因可能在WRKY68基因的调控下参与下游抗病反应。     

水稻白叶枯病抗性基因Xa7和Xa23资源的分子标记分析

水稻的白叶枯病抗性基因资源分析是抗病育种的重要工作。本研究利用与广谱持久抗性基因Xa7和Xa23紧密连锁的分子标记对水稻种质资源进行分析,并接种白叶枯病Ⅳ型菌进行田间抗性分析。结果显示,有32份资源携带Xa23,仅有2份资源携带Xa7,其中来自广东省内的资源分别为28份和1份;抗性达到中抗及以上的资源有47份。本研究为水稻抗白叶枯病基因资源的利用提供了依据。     

华中农大水稻团队解码抗白叶枯病主效基因

<正>白叶枯病是水稻生产中最常见的细菌性病害。利用主效抗病基因改良水稻品种一直是水稻生产中最重要的抗病策略。但是因为病原菌的变异,有些主效抗病基因的抗性容易丧失,利用具有持久抗性的抗病基因改良农作物一直是育种家的育种目标之一。在已经被利用的主效抗白叶枯病基因中,Xa4基因是应用范围最广、时间最长的一个。     

水稻抗白叶枯病基因的聚合育种

白叶枯病是严重危害水稻生产的重要病害之一,利用聚合多个抗性基因的水稻品种是控制该病害的有效途径。本研究以携带Xa4、xa5、xa13、Xa214个抗白叶枯病基因的IRBB60与8个水稻新品系,组配8个杂交组合.应用分子标记辅助选择技术从F2和F3群体中共获得216个携带4个抗白叶枯病基因的纯合体。用华南地区的5个白叶枯病病原菌小种进行田间接种的试验表明,4个抗性基因聚合系的抗性水平高于只带1个抗性基因的近等基因系。这些聚合系可用作华南地区高抗白叶枯病水稻品种育种的亲本材料。     

用mRNA差异显示法分离水稻抗白叶枯病相关基因

水稻抗病相关基因的克隆和功能研究有助于阐明水稻抗病性的分子机制。根据对水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)抗性基因Xa21和Xa1功能的研究^[1,2],水稻抗白叶枯病基因与白叶枯病菌无毒基因互作后,激活下游一系列防卫反应基因的表达。除抗病基因外,水稻中参与对白叶枯病抗性的调控基因和防卫基因有哪些？它们在结构和表达调控上与其他植物的调控基因和防卫基因有何异同？均不很清楚。ｍRNA差异显示技术(mRNA differential display, DD)是近年发展起来的一种用于研究诱导表达基因的有效方法^[3~6],已成功用于动物细胞及肿瘤发育的特异基因的鉴定和克隆,在分离水稻差异表达基因方面也有不少成功的报道^[7~9],这为我们在水稻白叶枯病上开展类似工作提供了理论依据。     

利用分子标记辅助选择聚合水稻基因Xa21和Pi9(t)

通过有性杂交和田间多代选育，利用分子标记辅助选择和田间／温室抗性鉴定，将广谱高抗白叶枯病的Xa21，基因和高抗稻瘟病的Pi9(t)基因聚合到同一品系中，获得双基因纯合且农艺性状稳定的株系。用中国7个和安徽省流行白叶枯病病菌以及多个稻瘟病小种进行抗病性鉴定，结果表明：双抗基因系同时抗白叶枯病和稻瘟病，抗性级别为HR-R，抗谱与供体亲本一致，抗性水平基本相当。室内考种结果显示：双抗基因系间株高变异较大；单株有效穗比两亲本弱；结实率和千粒重明显优于Xa21，基因的供体M12，与Pi9(t)基因的供体亲本75-1-127相当。     

利用分子标记辅助选择聚合Pi9(t)和Xa23基因

利用分子标记辅助选择将广谱高抗稻瘟病的Pi9(t)基因和全生育期高抗白叶枯病的Xa23基因聚合到同一优良株系中,获得了含双基因的优良株系L10～L13.用来自不同地区的20个稻瘟病小种和中国流行的7个白叶枯病小种及安徽白叶枯病小种对聚合株系进行接菌鉴定,结果显示:聚合Pi9(t)和Xa23基因的株系L10～L13同时抗稻瘟病和白叶枯病;与稻瘟病的供体亲本75-1-127相比,抗性水平相当,均达抗级(R)水平,且抗谱相同;与白叶枯病的供体CBB23相比,对白叶枯病的抗性时期一致,均表现为全生育期抗性,而且抗性水平和抗谱相似.通过田间农艺性状的筛选,获得的双基因聚合系具有较好的农艺性状,可直接应用于生产或作为抗性亲本.     

采用SSR标记辅助选育具有Xa22(t)的云南高原粳稻新种质

以高原粳稻新品种滇粳优1号为轮回亲本,携带Xa22(t)基因的云南地方稻种扎昌龙为供体亲本,回交后代BC3F1290株和BC3F2290个株行为供试材料,采用与Xa22(t)紧密连锁标记RM224及其它11对SSR．标记进行辅助选择。290株BC3F1个体在RM224位点上杂合基因型个体的比率为21．04％;其它11对SSR．标记位点的轮回亲本纯合基因型个体比率平均为93．07％,但不同染色体标记位点上纯合基因型的比率不同。用云南高原粳稻上的白叶枯病优势菌株YH24对亲本、BC3F1单株和BC3F2株行接种鉴定,BC3F1中RM224位点上杂合基因型的61个植株表现为抗至中抗,RM224位点上滇粳优1号纯合基因型单株都表现为感病;由RM224位点杂合基因型BC3F1单株衍生的61个BC3F2代株行表现为抗、感分离。     

水稻白叶枯病抗性基因Xa4、Xa23聚合及分子标记检测

本研究以含Xa23的水稻品种WBB1为亲本,分别与含Xa4的恢复系杂交,对后代进行白叶枯病菌系接种及SSR分子标记检测,进行Xa23和Xa4的聚合及Xa23显性程度观察,研究结果如下:1.含Xa23亲本与不同遗传背景品种杂交,F1代经鉴别菌系C1～C7及毒力强的P6接种,表现抗谱广.2.利用SSR标记RM206进行Xa23和Xa4杂交聚合的检测,RM206与Xa23紧密连锁且共分离,在亲本间存在多态性,在后代选择中准确性好.桂99×WBB1、R402×WBB1和IR30×WBB1的F2群体中的准确率分别达到了97%、96%和98%.这说明利用SSR标记RM206对白叶枯病抗性基因Xa23进行分子辅助选择育种是切实可行的.3.Xa23与Xa4聚合体比含Xa4的恢复系对白叶枯病的抗性有很大的提高,经C1～C7菌系接种,病斑普遍在1 cm以下,抗性水平达到高抗水平.     

水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的克隆及遗传转化

为了构建水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的植物表达载体并对其进行遗传转化,以水稻白叶枯病抗性品种‘扎昌龙’(ZCL)的基因组DNA为模板,通过长片段PCR扩增得到水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因Xa31(t)-1和Xa31(t)-2的序列,采用酶切、连接的方法先将目的基因克隆至T载体,筛选正确的质粒后,再克隆至pCMABIA1300表达载体。以农杆菌介导法将构建好的重组质粒转入‘日本晴’和‘台北309’的愈伤后诱导成苗,获得了大量转基因植株,这些工作为克隆白叶枯病抗性基因并研究其功能奠定了基础。     

Pyramiding of Xa7 and Xa21 for the improvement of disease resistance to bacterial blight in hybrid rice

‘Minghui 63’ is a restorer line widely used in hybrid rice production in China for the last two decades. This line and its derived hybrids, including ‘Shanyou 63’, are susceptible to bacterial blight (BB), caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). To improve the bacterial blight resistance of hybrid rice, two resistance genes Xa21 and Xa7, have been introgressed into ‘Minghui 63’ by marker‐assisted selection and conventional backcrossing, respectively. The single resistance gene‐introgressed lines, Minghui 63 (Xa21) and Minghui 63 (Xa7) had higher levels of resistance to bacterial blight than their derived hybrids, Shanyou 63 (Xa21) or Shanyou 63 (Xa7). Both Xa21 and Xa7 showed incomplete dominance in the heterozygous background of rice hybrids by infection with GX325 and KS‐1‐21. The improved restorer lines, with the homozygous genotypes, Xa21Xa21 or Xa7Xa7, were more resistant than their hybrids with the heterozygous genotypes Xa21xa21 or Xa7xa7. To further enhance the bacterial blight resistance of ‘Minghui 63’ and its hybrids, Xa21 and Xa7 were pyramided into the same background using molecular marker‐aided selection. The restorer lines developed with the resistance genes Xa21 and Xa7, and their derived hybrids were evaluated for resistance after inoculation with 10 isolates of pathogens from China, Japan and the Philippines, and showed a higher level of resistance to BB than the restorer lines and derived hybrids having only one of the resistance genes. The pyramided double resistance lines and their derived hybrids have the same high level of resistance to BB. These results clearly indicate that pyramiding of dominant genes is a useful approach for improving BB resistance in hybrid rice.     

水稻抗白叶枯病新基因Xa32（t）的鉴定和初步定位

通过多菌系接种鉴定及抗谱分析,并与目前国际上已知抗白叶枯病基因比较,证明在水稻抗源C4064中含有一个新的抗白叶枯病基因,暂命名为Xa32(t)。应用分离集团分析法(BSA),借助SSR和EST等分子标记,对该基因进行了分子标记定位。通过对F₂分离群体及F₃家系单株进行遗传连锁性检测,发现6个位于水稻第11染色体长臂末端的分子标记RM27256、RM27274、RM2064、ZCK24、RM6293和RM5926与Xa32(t)基因连锁。它们与Xa32(t)基因间的遗传距离分别为2.1、1.0、1.0、0.5、1.5和2.6 cM。其中标记RM6293和RM5926位于染色体近端粒一侧,其他4个标记RM27256、RM27274、RM2064和ZCK24位于基因的另一侧。将Xa32(t)定位在水稻第11染色体长臂末端2.0 cM范围内。     

水稻抗白叶枯病新基因Xa32（t）的鉴定和初步定位

通过多菌系接种鉴定及抗谱分析,并与目前国际上已知抗白叶枯病基因比较,证明在水稻抗源C4064中含有一个新的抗白叶枯病基因,暂命名为Xa32(t)。应用分离集团分析法(BSA),借助SSR和EST等分子标记,对该基因进行了分子标记定位。通过对F₂分离群体及F₃家系单株进行遗传连锁性检测,发现6个位于水稻第11染色体长臂末端的分子标记RM27256、RM27274、RM2064、ZCK24、RM6293和RM5926与Xa32(t)基因连锁。它们与Xa32(t)基因间的遗传距离分别为2.1、1.0、1.0、0.5、1.5和2.6 cM。其中标记RM6293和RM5926位于染色体近端粒一侧,其他4个标记RM27256、RM27274、RM2064和ZCK24位于基因的另一侧。将Xa32(t)定位在水稻第11染色体长臂末端2.0 cM范围内。     

不同Xa21转基因杂交稻组合的大田试验与分析

在北京、四川和江苏等地对Xa21转基因杂交稻进行了大田释放实验. 分别对转基因纯合的3个恢复系明恢63-Xa21、盐恢559-Xa21和C418-Xa21与各种不育系配组的23个杂交组合进行了抗性和农艺性状分析. 在不同的杂合遗传背景下转基因Xa21稳定遗传和高效表达, 所有杂交组合均具有对白叶枯病的广谱抗性. 转基因恢复系配制的杂交组合与     

转Xa21基因杂交水稻选育和评价

通过基因枪转基因方法和双质粒共转化体系将Xa21基因转入优良恢复系明恢63,得到转基因系M12和M22,并进一步做田间试验、新品种选育和食用安全性评价。结果显示:M12和M22对中国的所有白叶枯病小种都表现出高度抗性,但与原受体品种明恢63相比,农艺性状上有许多变异,主要表现在:结实率、千粒重等农艺性状变差,与珍汕97A的配合力显著降低;但与温敏不育系(X07S、056S)配组的F1有较好的田间表现。通过多代回交和分子标记辅助选择,成功地将Xa21基因从M12株系转到保持系80-4B和不育系80-4A中,得到抗白叶枯病的皖21B和皖21A。并利用皖21A不育系选育出优良杂交组合抗优97(皖21A×R-18),该组合在两年区域试验和一年生产试验中产量表现突出,米质优良。对不同世代和不同遗传背景的转基因品系进行白叶枯病鉴定和Southern分析表明:Xa21基因都能稳定遗传和正常表达,连续16代的种植并没使其白叶枯病的抗性减弱或丧失,而且不论Xa21基因是纯合的还是杂合的都有相同的抗性表现。对大鼠和小鼠的饲喂试验表明:转基因大米实质上等同于非转基因大米,是安全无害的。