不同冷冻-解冻精子浓度对猪卵母细胞体外受精的影响

[目的]探讨体外受精时不同精子浓度对精子穿入成熟卵母细胞及后续发育的影响。[方法]以冷冻-解冻精子为材料,以1×106、1×107个/ml 2种精子浓度进行体外受精,研究不同冷冻-解冻精子浓度对猪卵母细胞体外受精的影响。[结果]当精子浓度为1×106、1×107个/ml时,精子穿入率分别为83.18%、88.23%,单精入卵率分别为40.55%、9.02%,多精入卵率分别为59.45%、90.98%,平均每个卵母细胞中的精子数分别为2.03、3.26个,雄原核形成率分别为84.10%、86.40%,单精入卵率、多精入卵率有显著差异(P<0.05),其他指标无显著差异(P>0.05)。[结论]该研究为应用冷冻-解冻精子建立猪卵母细胞的体外生产系统提供了依据。     

不同处理对山羊精子转染外源DNA效率的影响

将采集的山羊精液去除精清,分为鲜精组、冻精组、反复冻融致死组3组进行处理后,与地高辛标记的线性化PCS2EGFP质粒共育转染,用免疫组化的方法检测精子转染外源DNA的效率.结果显示鲜精、冻精和反复冻融致死3种处理组的阳性转染效率分别为(36.61±7.91)%,(32.68±3.38)%,(69.36±4.79)%.反复冻融致死组转染率极显著高于鲜精组和冻精组(p＜0.01),鲜精组和冻精组转染效率差异不显著(p＞0.05).

Abstract：

Goat semen was centrifuged and divided into three groups:fresh sperm, frozen-thawed sperm and dead sperm by repeated frozen-thawed treatment. The sperms were incubated in vitro with foreign DIG-labeled linear PCS2EGFP plasmid. The transfection rates of the sperms were determined immunohistochemically. The results showed that the sperm DNA-binding rates were (36.61±7.91)%, (32. 68±3.38)%and (69. 36±4.79)%, respectively, for the above-mentioned three groups, and the sperm DNA-binding rate of dead sperms with repeated frozen-thawed treatment was significantly higher than that of the other two groups (p＜0.01).     

精子与慢病毒共孵育条件的优化以及转基因猪的制备

【目的】探索慢病毒与精子共孵育的方法,并制备转基因猪。【方法】采用正交试验分析精子密度、病毒量、精子与慢病毒共孵育时间、精子与慢病毒共孵育温度对精子活力的影响,采用PCR和Southern blotting检测转基因。【结果】①优化慢病毒与精子共孵育条件为：100 µL慢病毒原液（5×105cfu）与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min;②与病毒孵育后的精子（109个/mL）给母猪人工授精时,经PCR检测49头仔猪中有14头呈阳性;③Southern blotting结果表明,8头PCR阳性仔猪中,4头融合了外源基因。【结论】优化了精子与慢病毒共孵育的条件（100 µL慢病毒原液（5×105cfu）与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min）,成功制备了转基因猪,并检测有外源基因的融合。     

猪Jiv90基因打靶载体的构建与细胞转染试验

【目的】构建猪Jiv90基因的同源打靶载体,并转染猪血管内皮细胞系(SUVEC),对Jiv90基因的敲除效果进行初步验证。【方法】根据NCBI中公布的Jiv90基因序列,克隆得到Jiv90基因核心区两侧的基因序列,并以此为长短臂,构建了可定点敲除Jiv90基因的打靶载体。用该载体转染SUVEC,通过新霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)的筛选得到稳定的细胞株,再利用PCR检测neo基因在细胞基因组上的整合情况,最后对筛选得到的neo阳性细胞进行猪瘟病毒(CSFV)感染试验,并用实时定量PCR(Real-time PCR)检测CSFV的增殖情况。【结果】以提取所得品质良好的SUVEC全基因组DNA为模板,克隆得到了针对Jiv90基因打靶的核心区两侧基因序列,基因片段长度分别为4 522bp和1 944bp。将长短臂与打靶骨架载体pA2T相连后,构建了关于猪Jiv90基因的同源打靶载体JKS。用JKS载体转染SUVEC,通过1 500μg/mL G418和200nmol/mL GANC正负筛选,得到了稳定转染JKS载体的SUVEC。对于稳定筛选后的试验组细胞,感染CSFV并进行Real-time PCR,结果表明,正常细胞中的CSFV核酸含量是转染JKS载体细胞的3.65倍。【结论】成功扩增了针对猪Jiv90基因的同源长短臂,并构建了猪Jiv90基因的打靶载体JKS,敲除Jiv90基因细胞中的CSFV核酸片段含量显著降低,说明Jiv90基因的敲除可降低细胞中猪瘟病毒的增殖量。     

猪冷冻精子的体外受精与单精子胞浆内注射

用猪冷冻精子进行体外受精和单精子胞浆内注射(ICSI),并研究添加L-半胱氨酸及不同成熟培养法对猪ICSI胚胎发育的影响。结果表明:用猪冷冻精子生产的ICSI胚胎卵裂率及囊胚发育率分别为68.3%和11.4%,均低于用冷冻精子进行体外受精(IVF)所获得的卵裂率和囊胚发育率(分别为76.9%和19.2%,P<0.05)。在培养液中添加1.71mmol·L~(-1) L-半胱氨酸培养3 h,无论是卵裂率、桑椹胚发育率,还是囊胚发育率,均未得到明显改善(P>0.05);采用含0.4%BSA的NCSU-23培养液进行猪卵母细胞成熟培养,ICSI胚胎卵裂率虽明显高,但各组所获胚胎发育率均无显著差异(P>0.05),表明所用卵母细胞的成熟方法并未对ICSI胚胎发育产生明显的影响;用颗粒细胞或卵丘细胞共培养ICSI胚胎后,卵裂率有明显提高(P<0.05),但各组囊胚发育率无统计学差异。     

猪精液稀释液中不同水质对精子活力的影响

通过对猪精液稀释液采用不同水质的试验研究，结果表明：无污染的高山矿泉水和质量好的蒸馏水作稀释用水的精子存活时间最长，而用天然河水作稀释用水的精子存活时间最短。     

精子与慢病毒孵育制备转基因猪的分子检测及遗传分析

【目的】在前期精子与慢病毒孵育法制备的转基因猪基础上,进一步探讨外源基因在转基因猪上的遗传状况.【方法】通过转基因猪与野生猪交配扩繁后,运用PCR和Southern-blot法对转基因G_1和G_2代进行外源基因的检测与遗传分析.【结果和结论】采用PCR法检测,G_1代PCR阳性率为25.42%(15/59);G_2代PCR阳性率为46.67%(7/15).在12头阳性转基因猪的13种组织中,外源基因在多种组织中均有存在;对阳性转基因猪的胃、垂体、下丘脑组织的RT-PCR检测结果显示,外源基因在66.67%(24/36)的组织样品中均有表达.表明在精子与慢病毒共孵育法制备的转基因猪中,外源基因能整合到猪的基因组,并遗传给后代.     

新型穿膜肽介导p53融合蛋白的表达及其免疫原性分析

目的:原核表达新型细胞穿膜肽RDP介导p53融合蛋白,并检测其免疫原性的强弱.方法:以质粒pET28ap53为模板扩增p53基因,并克隆至原核表达载体pET28a-RDP中,构建重组表达质粒pET28a-RDP-p53,转化至大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达蛋白并纯化,SDS-PAGE确定该蛋白准确性.同时,将昆明小鼠分为空白对照组(等容生理盐水)和RDP-p53融合蛋白高、中、低剂量(4mg/kg,2mg/kg,1mg/kg)组,经腹腔注射免疫,每隔2d给药1次,30d后眼球取血,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中IgG的含量.结果:双酶切及测序结果显示,p53基因已克隆入表达载体中;RDP-p53融合蛋白在上清和沉淀中均获得表达.ELISA测定结果表明,与对照组比较,低、中剂量组小鼠血清中IgG含量没有明显升高(p0.05),高剂量组显著升高(p0.05).结论:成功表达并纯化RDP-p53融合蛋白,其免疫原性较弱且与给药剂量相关,为进一步研究RDP-p53融合蛋白对脑肿瘤的药理作用奠定基础.     

不同稀释液对猪精子活力与保存时间的影响

通过研究不同配方的稀释液在相同的稀释倍数及同一保存条件下,对猪精子活力的影响来选择合适的猪精稀释液。试验选用灌南县家畜改良站内的4头成年公猪的精液作为材料,采用4种稀释液配方,分别进行稀释,观察精子活力和保存时间。结果表明,用葡—柠—乙液稀释的精液,在32h内精子活力平均数显著高于葡萄糖液和葡—柠液,精子存活时间也长于其它稀释液。     

新型穿膜肽介导 p53融合蛋白的表达及其免疫原性分析

目的：原核表达新型细胞穿膜肽RDP介导p53融合蛋白,并检测其免疫原性的强弱．方法：以质粒pET28a‐p53为模板扩增p53基因,并克隆至原核表达载体pET28a‐RDP中,构建重组表达质粒pET28a‐RDP‐p53,转化至大肠杆菌Rosetta ,IPTG诱导表达蛋白并纯化,SDS‐PAGE确定该蛋白准确性．同时,将昆明小鼠分为空白对照组（等容生理盐水）和RDP‐p53融合蛋白高、中、低剂量（4 mg／kg ,2 mg／kg ,1 mg／kg）组,经腹腔注射免疫,每隔2 d给药1次,30 d后眼球取血,用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中IgG的含量．结果：双酶切及测序结果显示, p53基因已克隆入表达载体中;RDP‐p53融合蛋白在上清和沉淀中均获得表达．ELISA测定结果表明,与对照组比较,低、中剂量组小鼠血清中IgG含量没有明显升高（p＞0.05）,高剂量组显著升高（p＜0.05）．结论：成功表达并纯化RD P‐p53融合蛋白,其免疫原性较弱且与给药剂量相关,为进一步研究RD P‐p53融合蛋白对脑肿瘤的药理作用奠定基础．     

温度和保存时间对猪精子顶体酶活性的影响

为了探讨温度和液相保存时间对猪精子顶体酶活性的影响,采用紫外分光光度计检测猪精子顶体酶活性。结果显示:(1)鲜精、冷休克和热休克每106精子顶体酶活性分别为5.38、5.20和5.16 mIU,差异不显著(P>0.05)。(2)鲜精在4、17、25、30、37和39℃时每106精子顶体酶活性分别为4.29、5.01、5.03、5.17、4.78和4.61 mIU,随着温度的升高精子顶体酶活性逐渐提高,当温度达到30℃时达到最高,且4℃和30℃时差异显著(P<0.05)。(3)液相精液在4℃保存超过1 d时精子顶体蛋白酶活性显著下降(P<0.05);在17、25和39℃保存超过2 d时顶体酶活性显著下降(P<0.05),且在17℃保存效果较好。结论是猪精子顶体蛋白酶活性受温度的影响,在17℃的条件下3 d内保存的猪精子顶体酶活性最佳。     

不同抗氧化剂对金华猪精液冷冻保存效果的影响

为了观察冷冻稀释液中添加不同浓度的抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)、绿茶多酚(GTPs)、维生素E(VE)和超氧化物歧化酶(SOD)对金华猪精液冷冻保存效果的影响,分别在冷冻稀释液中添加0.125、0.25、0.5 mmol.L-1的GSH,10、15、20 mmol.L-1的GTPs,1、2、4 mg.mL-1的VE和1 000、2 000、4 000 I U的SOD,采集活率较高的金华猪精液,用上述含抗氧化剂的冷冻稀释液稀释后进行冷冻保存,分别检测4个处理组精子4℃平衡后的活率和解冻后精子活率、质膜完整性、顶体完整率。结果表明,在金华猪精液的冷冻稀释液中分别添加15 mmol.L-1GTPs、2 mg.mL-1VE、4 000 I U SOD可显著提高猪精子4℃平衡后的活率、解冻后精子活率和质膜完整率(P0.05)。     

不同时间跨度表型资料对种猪遗传评估的影响

以杜洛克猪主要生长性状为研究对象,评估不同时间跨度、相同个体估计育种值（EBV）的准确性和排名的差异。利用DMU软件和单性状动物模型估计了主要生长性状的方差组分,并计算性状的遗传力;划分不同时间跨度,包括2年、3年、4年、5年和全部数据,评估验证群体个体的EBV准确性及其与利用全部数据时评估育种值的秩相关。结果表明,115 kg体重日龄（AGE）、30~115 kg日增重（ADG）、115 kg体重背膘厚（BF）、115 kg体重眼肌面积（LEA）和综合体型评分（BCS）的遗传力分别为0.22、0.16、0.38、0.30和0.09,除BCS外,均为中高遗传力性状。固定方差组分情况下,AGE、ADG、BF、LEA和BCS的EBV准确性变化范围分别为0.62~0.64、0.56~0.59、0.72~0.73、0.67~0.69和0.49~0.53;不固定方差组分情况下,各性状EBV准确性变化范围分别为0.64~0.65、0.51~0.59、0.61~0.73、0.67~0.69和0.42~0.53;不同条件下,秩相关均较为接近。利用群体全部数据计算方差组分作为先验值,优于利用阶段数据方差组分估计值时EBV准确性;不同时间跨度下,EBV排名差异较小,可适当缩小数据取值时间范围。     

不同抗冻保护剂对鸡精液冷冻效果及基因表达的影响

旨在研究不同抗冻保护剂对鸡精液的冷冻保存效果,并通过比较差异表达基因,以解释不同保护剂的抗冻机制.以海兰褐种公鸡为研究对象,检测了不同抗冻保护剂(保护剂Ⅰ和保护剂Ⅱ)冷冻保存后的精子活性,并利用Affymetrix表达谱芯片检测技术,对差异表达相关基因进行筛选.结果表明:1)保护剂Ⅰ组的精液冻后活力活率(27.05±1...     

不同冻融处理对猪精子顶体膜蛋白表达的影响

为探究不同冷冻解冻方法对猪精子损伤的影响,采用2种常用的冷冻解冻方法处理猪精子,分别对其顶体膜蛋白进行分离,进行SDS-PAGE电泳和总灰度值的检测和分析。结果表明,采用一次稀释法进行猪精液的冷冻保存较二次稀释法解冻后精子活率高,精子顶体膜蛋白组分中除125 ku和90 ku处蛋白表达水平低于二次稀释法外,120 ku、48 ku、36 ku均高于二次稀释法。可见,猪精子在受到更深层次(二次稀释法对精子冷冻解冻损伤大)的冷冻损伤时,伴随着顶体膜蛋白125 ku和90 ku表达水平的升高以及120、48及36 ku表达水平的降低。     

不同预处理方法对酶法制备的草鱼鳞胶原蛋白肽特性的影响

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)鳞为原料,采用3种常用工业蛋白酶酶解3种经不同预处理方法处理过的鱼鳞,经酶解、离心分离、冷冻干燥等工序制备胶原蛋白肽,比较不同预处理方法制得胶原蛋白肽的产率及产物特性。结果表明,预处理方法对鱼鳞酶解产物的氮收率、水解度和氨基氮生成量有显著影响(P0.05),适宜的预处理方法为热处理结合粉碎处理;预处理方法对产物的分子质量及其分布影响不明显,产物的高效液相图谱均有3大组分峰,分别在10 000~14 000、8 000~9 000、4 000ku附近;预处理方法对胶原蛋白肽的DPPH·清除率影响显著,主要受热处理影响,粉碎处理的影响较小。综合胶原蛋白肽的产率及产物特性,理想的鱼鳞预处理方法为热处理结合粉碎处理。     

牛磺酸对不同年龄大鼠睾丸组织抗氧化能力的影响

通过在饮水中添加牛磺酸和β-丙氨酸(牛磺酸转运抑制剂),探讨牛磺酸对不同年龄大鼠睾丸组织抗氧化能力的影响.结果表明:牛磺酸对青年大鼠睾丸组织CAT、T-AOC、MDA、NOS、NO、GSH-Px和GSH活性或含量没有明显影响,但可显著提高SOD活性;牛磺酸对老年大鼠睾丸组织CAT、T-AOC、MDA没有明显影响,但可显著提高SOD、NOS、NO、GSH-Px和GSH活性或含量.说明牛磺酸可提高大鼠尤其是老龄大鼠睾丸组织的抗氧化能力,减轻自由基对睾丸组织的损伤.     

不同比例猪粪有机肥配施对稻穗不同部位氮含量分布的影响

[目的]探讨施用猪粪有机肥对稻穗不同部位籽粒氮素积累的影响,为提高水稻肥料利用率和畜禽粪便的资源化利用提供参考依据.[方法]以赣晚籼37号为材料,在水稻施纯N 180 kg/ha,N:P2O5:K2O=3:1:2.5的情况下,比较并分析全施化肥(NPK)、低量猪粪配施化肥(F7M3,即70%化肥配施30%猪粪)、中量猪粪配施化肥(F5M5,即50%化肥配施50%猪粪)和高量猪粪配施化肥(F3M7,即30%化肥配施70%猪粪)等处理的枝梗籽粒氮含量、穗位籽粒氮含量、稻穗氮含量、水稻籽粒吸氮量及其与水稻产量的关系.[结果]配施猪粪有机肥能有效降低水稻一次、二次枝梗籽粒氮含量,且随猪粪有机肥配施量的增加,穗位籽粒氮含量也呈降低趋势,其中F3M7处理上、中、下部的籽粒氮含量较NPK处理分别显著降低11.6%、11.9%和9.1%(P<0.05,下同).增施猪粪有机肥能促进水稻产量增加与稻穗氮含量下降,与NPK处理相比,猪粪配施处理的稻穗氮含量显著下降5.7%~10.1%,水稻产量增加4.3%~14.1%,但猪粪有机肥配施处理的水稻籽粒吸氮量与NPK处理无明显差异,均在92.0 kg/ha左右.[结论]猪粪有机肥与化肥配施能有效影响稻穗不同部位的氮含量,合理利用有机肥资源有利于水稻的高产稳产.     

不同养殖规模下生猪疫病风险认知对养猪户生物安全行为的影响——基于河北省786个养猪户的调查

为了解动物疫病风险认知对养殖户生物安全行为的影响,本研究以河北省786个生猪养殖户为调研对象,通过建立多元有序Logistic模型,研究了生猪疫病风险认知对养猪户生物安全行为的影响,并引入养殖规模作为解释变量,分析了不同规模养猪户生物安全行为和生猪疫病风险认知差异。结果表明:1)养猪户生猪疫病风险认知对其生物安全行为采纳有显著影响,其中外部环境风险认知影响最大,其次是生猪易感性风险认知和生猪病原的危险性风险认知;2)大、中、小和散户4种养殖规模对养猪户生物安全行为有显著影响,且不同养殖规模下其生物安全行为偏好有所差异;3)不同规模养猪户的生猪疫病风险认知有一定差异;4)养猪户生物安全行为受其个人特征、经营特征等多种因素影响。据此,本研究提出加强养猪户生猪疫病风险认知培训,分类施策促进不同规模养猪户生物安全行为建设,鼓励养猪户向规模化、标准化方向发展,培养新型养猪人等政策建议。     

荣昌猪杂交组合测定及分析

以荣昌猪保种核心群为基础,对荣昌猪不同组合的两系和三系杂交后代进行繁殖、生长、胴体及肉质 性能方面的指标测定。结果表明,在繁殖性能上,大约克× 荣昌（YR）二杂经产母猪总产仔数为13.07（±2.5）,与 母猪长白× 荣昌（LR）二杂母猪无显著差异,但显著优于纯种荣昌猪,繁殖性能的杂交优势明显;在生长速度方 面,LR 的日增重为635.28 g,显著高于YR 的日增重593.41 g;杜洛克×长白× 荣昌（DLR）三系杂交商品猪的日增 重和达100 kg 日龄分别为775.88 g、190 d,极显著高于杜洛克× 大约克× 荣昌（DYR）商品猪的相应指标。在胴 体和肉质方面,LR 和YR、DLR 与DYR 在大多数指标上无显著差异。