利用高通量测序技术分析IHHNV感染凡纳滨对虾的基因差异表达

[目的]研究传染性皮下及造血组织坏死病毒（Infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus,IHH-NV）感染凡纳滨对虾的基因差异表达,为进一步了解IHHNV与凡纳滨对虾的相互作用分子机制提供参考.[方法]采用454高通量测序技术对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾进行转录组测序,测序获得的序列除去接头后用iAssembler软件进行拼接得到unigene（单一基因序列）,通过计算各unigene的转录本数目（RPKM）确定差异表达基因,并以实时荧光定量PCR验证基因的差异表达.[结果]采用454高通量测序技术对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾进行转录组测序,共获得208690条短序列,序列拼接共得到21912条tmigenes;通过对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾的测序数据比较分析,结果发现221个差异表达基因,包括81个上调表达基因和140个下调表达基因.经实时荧光定量PCR验证,454高通量测序数据统计的基因表达差异结果可靠.[结论]IHHNV感染显著影响凡纳滨对虾免疫相关基因的表达,而利用高通量测序技术可有效检测出这些差异表达基因.     

凡纳滨对虾池塘水质及对虾肌肉品质的对比分析

2010年5-9月期间,对上海奉贤区两个养殖场采取不同养殖方式的22个凡纳滨对虾养殖塘的水温(T)、总溶解盐（TDS）、溶解氧（DO）、pH、透明度（SD）、亚硝酸盐氮（NO2 N）、总氨氮（TAN）、硝酸盐氮（NO₃N）、总氮（TN）、活性磷（PO₄P）、总磷（TP）、叶绿素a（Chl.a）、五日生化需氧量（BOD₅）等因子进行监测,其中1号场养殖用水为经沉淀处理的天然河水,而2号场则为添加了海水晶的河水。结果表明：试验期间水体的温度、DO、pH变化幅度不大,基本可满足凡纳滨对虾生长的条件;总体上硝酸盐氮（NO₃N）在无机氮（TIN）中所占比例最高,总氨氮（TAN）在TIN中所占比例随养殖周期的推延而增加,养殖后期NO₂N所占比例升高趋势明显;活性磷含量则逐渐下降,总磷逐渐升高; BOD5、叶绿素a的含量随时间延长而逐渐上升。测定了两个养殖场成虾的肌肉品质结果如下：1号场南美白对虾肌肉的粗蛋白和粗脂肪含量分别为16.30%和1.42%,低于2号场的18.30%和1.61%;1号场成虾氨基酸总量为23.27%,其中必需氨基酸含量为9.09%,而2号场则分别为27.52%和10.74%;在鲜味氨基酸方面,1号、2号养殖场的含量分别为 8.52%和10.16%。     

盐度对养殖凡纳滨对虾肌肉营养成分的影响

凡纳滨对虾是一种优质对虾,隶属于广盐虾类,盐度会影响其营养成分、质量和味道。为了研究盐度对养殖凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）肌肉基本营养成分、氨基酸和脂肪酸组成与含量的影响,选取盐度5、26、30、50 环境下养殖90 d的凡纳滨对虾进行营养成分分析。结果显示：（1）肌肉的水分随盐度升高而呈下降趋势,粗蛋白和灰分含量随盐度升高而升高,而不同盐度组中肌肉粗脂肪含量无显著性差异（P>0.05）。（2）氨基酸总量（TAA）和必需氨基酸含量（EAA）在盐度26时最高,呈味氨基酸含量随着盐度的升高而呈下降趋势。18种常见氨基酸中有3种氨基酸（Ser、 Glu 和 His）的含量随着盐度的升高而下降,有10种氨基酸含量在盐度26时含量最高。（3）肌肉中主要饱和脂肪酸（SFA）含量为14.5%~23.2%,单不饱和脂肪酸(MUFA)含量为15.3%～27.1%,多不饱和脂肪酸（PUFA）含量为9.0%~24.6%;凡纳滨对虾的气味前体脂肪酸含量在盐度26或30时略高于其他其他盐度组（P>0.05）。不同盐度条件下养殖的凡纳滨对虾体内的水分、蛋白质、氨基酸、脂肪酸等生化成分有所变化。     

微囊藻毒素MC-LR对凡纳滨对虾细胞免疫相关基因表达水平的影响

对凡纳滨对虾进行血窦注射微囊藻毒素MC-LR染毒,取染毒前后肝胰腺及血细胞,采用Illumina Hiseq 2500测序平台进行基因表达谱分析,并对差异基因的基因本体(gene ontology,GO)注释和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路进行显著性富集分析。结果发现,酚氧化酶原、胰蛋白酶及C型凝集素等基因有显著的差异性表达。在GO富集性分析中发现细胞粘附显著性差异表达,细胞杀伤及细胞粘附分子结合物差异表达。KEGG富集性分析发现血细胞中吞噬体显著性差异表达,细胞凋亡、内吞作用和细胞粘附分子等通路呈表达差异。结果表明,凡纳滨对虾在被MC-LR染毒后,细胞免疫是抵御毒素的重要部分,其中细胞粘附和吞噬作用在抵御MC-LR对虾体的毒害过程中发挥了重要作用。     

凡纳滨对虾COPE基因序列及低温表达分析

通过对已知耐寒候选基因-COPE基因的克隆和研究,为凡纳滨对虾耐寒性状的分子机理研究提供依据。运用同源克隆和RACE-PCR技术获得凡纳滨对虾COPE基因(LvCOPE)全长cDNA序列,对其进行了生物信息学分析,采用荧光定量PCR研究了LvCOPE基因的组织表达谱及其在低温胁迫下表达量的变化。结果显示,LvCOPE cDNA全长1217 bp,包含888 bp开放阅读框,编码296个氨基酸残基,具有保守的TPR结构域。各物种COPE蛋白序列构建的系统进化树能准确反映各物种间的进化关系。Lv-COPE mRNA在各组织中呈遍在表达,在肌肉组织中表达量最高。低温表达谱分析显示,LvCOPE mRNA在低温处理对虾的肝胰腺、心、鳃、肌肉等组织中均呈下调表达,随着处理温度由15℃降至11℃度,其在肝胰腺中表达量逐渐降到最低。因此,LvCOPE在结构和进化上保守,在低温胁迫时呈下调表达,可能在寒冷耐受过程中发挥负调控功能。     

凡纳滨对虾不同养殖模式下微生物群落结构分析

为了解不同养殖模式对凡纳滨对虾养殖环境微生物多样性和群落结构的影响,利用高通量测序技术,结合生物信息学分析,比较凡纳滨对虾主养模式和鱼-虾混养模式中水体、底泥以及虾肠道微生物的多样性和群落结构。结果显示,无论是物种的多样性水平还是丰富性水平,均是底泥>水>虾肠道,主养池塘底泥和虾肠道样品的物种多样性和丰富性均高于混养池塘。不同样品微生物群落的菌群分布于59个门,其中10个门的丰度>1%,变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)属于绝对优势菌群,在混养池塘和主养池塘中均>10%。主养池塘的微生物标志物共有8个类群,分别为双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)等,混养池塘的微生物标志物共有18个类群,分别为蓝色芽殖杆菌属(Gemmobacter)、外硫红螺菌科(Ectothiorhodospiraceae)、外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira)等。通过功能预测及其相对丰度比较,发现主养模式在这些代谢通路中...     

凡纳滨对虾eIF5A基因的克隆及表达分析

真核细胞翻译起始因子5A(eIF5A)是真核生物细胞内的蛋白质翻译起始因子.近年来的研究发现eIF5A在动植物细胞衰老死亡、环境胁迫应答和免疫应答等过程中起着重要的调控作用.通过对凡纳滨对虾cDNA文库进行测序,首次获得了包含eIF5A完整的氨基酸序列的cDNA.该cDNA包含474 bp的开放阅读框,编码157个氨基酸,预测分子量约为17.257 ku,理论等电点为5.06.凡纳滨对虾eIF5A和其他物种对比结果显示,该基因的氨基酸序列和其他物种有较高的同源性.实时定量RT-PCR结果显示,eIF5A基因在凡纳滨对虾不同组织中的mRNA表达没有明显的差异.对WSSV、TSV和IHHNV感染的凡纳滨对虾的肝胰腺的实时定量RT-PCR结果显示,病毒感染的凡纳滨对虾的eIF5A基因的表达明显增加,分别是对照样品表达量的2.2、2.5和1.6倍,表明eIF5A可能涉及凡纳滨对虾的抗病毒免疫应答.     

凡纳滨对虾室内生态育苗技术

介绍了凡纳滨对虾室内生态育苗技术,包括设施与材料、育苗车间消毒处理、育苗用水处理、无节幼体投放、培育管理、生物饵料培养、常见疾病的防治方法等方面内容。最后,对凡纳滨对虾室内生态育苗的关键技术进行了讨论。     

凡纳滨对虾营养需求研究

凡纳滨对虾是目前世界上养殖虾类产量最高的三大品种之一,是水产养殖中非常重要的物种.提高凡纳滨对虾的产量是水产养殖中的重要课题.综合现有关于凡纳滨对虾营养学的研究,从蛋白质、脂类、碳水化合物、微生物和矿物质几个方面出发,分析凡纳滨对虾生长的营养需求.对凡纳滨对虾营养需求的分析能够为改善和控制凡纳滨对虾的生长、提高营养物的消化利用率,从而进一步研究凡纳滨对虾生长所需的最佳营养素配比、构建营养更加均衡的饲料提供重要参考.     

淡水养殖凡纳滨对虾生长相关基因HDAC1克隆及其表达分析

【目的】分析组蛋白去乙酰基酶1基因（HDAC1）在不同淡水生长特性家系凡纳滨对虾中的表达情况,明确HDAC1基因在对虾淡水养殖过程中的功能作用,为揭示凡纳滨对虾生长调控的分子机制提供参考依据。【方法】通过RACE克隆凡纳滨对虾HADC1基因cDNA序列,利用DNAMAN、ProtParam、ProtScale、PSOR...     

上海凡纳滨对虾源副溶血弧菌耐药性及其耐药基因检测分析

【目的】掌握上海地区养殖凡纳滨对虾源副溶血弧菌的耐药性及耐药基因携带情况,并明确耐药表型与耐药基因间的相关性,为科学防控凡纳滨对虾副溶血弧菌病及揭示耐药机制提供理论依据。【方法】通过K-B纸片扩散法检测21株上海凡纳滨对虾源副溶血弧菌对14种常见抗生素的敏感性,采用二倍稀释法测定高度敏感抗生素对副溶血弧菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）,并以PCR检测其耐药基因的携带情况,包括β-内酰胺类耐药基因blaTEM和blaCARB、磺胺类耐药基因Sul II和Sul III、氨基糖苷类耐药基因strA和str B、四环素类耐药基因tetA及I类整合子inT1基因。【结果】21株上海凡纳滨对虾源副溶血弧菌对14种常见抗生素表现出不同程度的多重耐药性,六重耐药1株（4.76%）,五重耐药3株（14.29%）,四重耐药5株（23.81%）,三重耐药8株（38.10%）,二重耐药4株（19.05%）;AMP/PG/SMX和PG/SMX为优势耐药菌谱。上海凡纳滨对虾源副溶血弧菌对恩诺沙星的敏感率最高（90.48%）,对应的MIC为0.10~1.60μg/mL、MBC为3.20~12.80μg/mL。blaTEM、blaCARB、Sul II、Sul III、str B和inT1等耐药基因的检出率分别为23.81%、71.43%、33.33%、19.05%、9.52%和23.81%,未检测出strA和tetA基因。从21株上海凡纳滨对虾源副溶血弧菌中共检出11种耐药基因型,其优势耐药基因型有blaCARB（28.57%）、blaCARB-blaTEM（14.29%）、blaCARB-Sul II（14.29%）和Sul III-inT1（9.52%）。除str A基因和tetA基因外,其余耐药基因与其对应抗生素耐药表型间均存在相关性,但其相关性不显著（P>0.05）。【结论】上海凡纳滨对虾源副溶血弧菌对14种常见抗生素表现出不同程度的敏感性,对恩诺沙星的敏感性最高,故可考虑将恩诺沙星作为上海地区凡纳滨对虾副溶血弧菌病防控的备选药物。此外,针对对虾源副溶血弧菌日趋严重的多重耐药问题,应同时加强副溶血弧菌耐药基因及整合子携带情况的监测,掌握其流行趋势,以提高对虾副溶血弧菌病的防控策略。     

酵母硒对凡纳滨对虾生长和抗氧化性能的影响

【目的】研究饲料中添加不同水平酵母硒对凡纳滨对虾生长和抗氧化性能的影响.【方法】选取初始体质量为(0.41±0.01)g的凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei 720尾,随机分为6个试验组,每组3个重复,每个重复40尾虾,在室内循环水养殖系统(容积250 L)中进行为期56 d的生长试验.在基础饲料中分别添加硒(酵母硒)0、0.15、0.30、0.45、0.60、1.00 mg·kg-1,制成6种不同硒水平的半纯化饲料,实测饲料硒质量分数分别为0.25、0.41、0.56、0.68、0.84、1.20 mg·kg-1.【结果和结论】结果表明,添加酵母硒对凡纳滨对虾增质量率、特定生长率、饲料系数、成活率均无显著影响(P0.05),随着饲料硒水平的增加,凡纳滨对虾的增质量率和特定生长率不断升高,在0.84 mg·kg-1硒组达到最大值.各试验组对虾肝胰腺超氧化物歧化酶和总抗氧化能力均高于对照组,而丙二醛含量均低于对照组,但差异不显著(P0.05).以增质量率和特定生长率为评价指标,通过二次线性回归分析表明,在该试验条件下凡纳滨对虾饲料中硒含量为0.98 mg·kg-1时其生长性能最高.     

池塘养殖凡纳滨对虾幼虾到成虾阶段生长差异研究

为探究池塘养殖条件下凡纳滨对虾幼虾至成虾阶段不同个体间存在的生长差异,本实验采集了放苗后第28、38、48、58、68和73天的对虾样品。首先以28天对虾样品为例,计算不同体质量虾所占比例;按体质量排序的前10%(14只)、中位数附近10%(14只)、后10%(14只)定义对虾生长速率高、中、低3组,其次对对虾的体长、体质量分别进行幂函数拟合和线性回归,比较不同生长特性虾之间的差异。再分别计算所有样品及不同生长速率组虾的绝对日增长、绝对日增重和相对日增长率、相对日增重率。结果发现,相同生长时期的3组虾生长速率差异显著(P95%),将这些生长速率不同的虾作为一个整体来分析虾的生长情况可能会出现一定偏差。其次,体长对体质量的线性回归结果为:幂函数W_(所有样品)=1×10~(-5)L~(3.0051),直线方程y_(所有样品)=3x-4.92,不同生长速率组的直线方程分别为y_高=3.41x-5.71,y_中=3.21x-5.30,y_低=2.92x-4.78;直线方程中斜率与生长速率呈正相关,3组线性回归方程能更加确切地反映出3组虾的真实生长情况;同时发现,不同生长速率虾的绝对生长值与对虾的实际生长情况吻合,而相对生长值与对虾的实际生长情况不相符,建议以后分析对虾生长特性时参数选择绝对生长值更为适宜。     

摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

驯化硝化型生物絮体养殖南美白对虾的初步研究

尝试在养殖中期逐渐降低碳源添加量至零,探讨驯化硝化型生物絮体对生物絮凝高密度南美白对虾养殖系统的水质、生物絮体细菌群落动态变化和对虾生长性能的影响。实验在3个跑道式养殖系统中进行,放养密度均为685尾/m~3。水质结果表明养殖前1~45 d,每日按日投饵量的100%~150%添加葡萄糖,能很好地降低氨氮的浓度,但对亚硝酸盐氮处理效果不明显。投糖量下降至零后,氨氮仍能维持在较低水平,亚硝酸盐氮浓度明显下降。利用高通量测序技术对生物絮体的细菌群落结构进行分析。检测结果表明在门水平上,异养型和硝化型生物絮体的主要优势菌群都是Proteobacteria(变形菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)。在纲水平上,异养型生物絮体的优势菌群是Alphaproteobacteria(α-变形菌纲),而硝化型生物絮体的优势菌群有Alphaproteobacteria(α-变形菌纲)、Flavobacteria(黄杆菌纲)和Gammaproteobacteria(γ-变形纲)。系统在65 d后不添加碳源情况下,生物絮体的异养细菌丰度减少,硝化螺旋菌属(Nitrospiral)开始快速增多并发展成为硝化细菌的优势菌群属,异养型生物絮体逐渐转变为硝化型生物絮体。实验结束时,总投糖量占总投饵量的41.03%±7.86%。南美白对虾的存活率和产量分别为43.35%±7.57%和(3.03±0.59)kg/m3。研究表明驯化硝化型生物絮体能优化高密度零水交换对虾养殖系统生物絮体的细菌群落结构和丰度,改善养殖水环境,保证对虾的生长和存活,节约成本。     

不同凡纳滨对虾养殖群体的微卫星遗传多样性分析

【目的】明确不同凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）养殖群体间的遗传信息丰富度和遗传分化程度,为构建适应上海独特气候对虾品种繁育计划中的交配系谱分析提供参考依据。【方法】选用13对微卫星引物对来自厄瓜多尔恒兴对虾养殖公司2个养殖场（Pesquera和San Alfonso）共9个凡纳滨对虾养殖群体进行遗传多样性分析,探究不同群体间的遗传信息丰富度和遗传分化程度。【结果】13个微卫星位点在9个凡纳滨对虾养殖群体中检测到的等位基因数（Na）为2～6个,共有37个等位基因,多态信息含量（PIC）为0.1292～0.6799,平均为0.3326。在13个微卫星位点中,仅有1个微卫星位点（TUMXLV9.116）呈高度多态性,有4个微卫星位点（TUMXLV10.147、TUMXLV5.45c、TUMXLV10.191c和TUMXLV10.96）呈低度多态性,其余8个微卫星位点呈中度多态性。9个凡纳滨对虾养殖群体的观测杂合度（Ho）为0.2225～0.3662,平均为0. 2915;期望杂合度（He）为0.3317～0.4539,平均为0. 3974;Hardy-Weinberg平衡指数（D）为0.0214～0.4214,其中San Alfonso P23群体和Pesquera P23群体的D相对更接近于0,其基因型分布接近于Hardy-Weinberg平衡状态。9个凡纳滨对虾养殖群体的F_st平均值为0.1259,说明有12.59%的遗传分化来源于群体间,而87.41%的遗传分化来自群体内部;群体间的平均基因流（Nm）为1.7356,表明遗传漂变未能主导种群遗传结构的变化。在9个凡纳滨对虾养殖群体间,以Pesquera 29群体与Pesquera 15群体的遗传距离最大（0.2426）,San Alfonso 23群体与Pesquera 23群体的遗传距离最小（0.0215）;基于遗传距离的UPGMA聚类分析结果表明,9个凡纳滨对虾养殖群体可分为两大类,其中Pesquera 29群体和San Alfonso 12群体独立聚为一类。【结论】在9个凡纳滨对虾养殖群体中存在观测等位基因丢失现象,且遗传多样性较低,群体间分化程度为中等水平。因此,可通过引进不同地区拥有不同遗传背景且亲缘关系较远的群体作为亲本,以丰富子代群体的遗传多样性。     

南美白对虾养殖水体中霍乱弧菌的毒力、耐药及重金属抗性研究

旨在分析南美白对虾养殖水体中霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的毒力、抗菌素耐药性以及重金属抗性特性,为致病性霍乱弧菌流行预警的研究提供数据支撑。利用聚合酶链反应技术检测了84株霍乱弧菌分离菌株的毒力以及整合接合元件(ICEs)相关基因;采用美国临床与实验室标准研究所(CLSI)标准Kirby-Bauer纸片扩散法以及最小抑菌浓度法测定了受试菌株的抗菌素和重金属抗性;运用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对部分受试菌株进行了分子分型。结果显示:受试霍乱弧菌菌株均不携带致病性肠毒素基因ctxA B以及毒素相关基因sto、tcpA、ace、zot;含有毒素表达调控蛋白基因toxR,其中19.05%菌株还含有RTX家族毒素基因rtxA;携带SXT-R391家族ICEs保守功能模块部分相关基因(int、traI、traC、setR、attR)。受试霍乱弧菌菌株对六大类十种抗菌素的耐药性存在显著差异,其中对氨苄西林的耐药率最高为13.10%,其次是庆大霉素(2.38%);利福平、链霉素、氨苄西林、卡那霉素、壮观霉素的中介耐药率为25.00%~1.19%;对四环素、氯霉素、甲氧胺苄嘧啶、复方新诺明均敏感。此外,30%的受试霍乱弧菌菌株对重金属铅、锌具有高度抗性,而对铬、镉、铜、镍、汞、钡敏感;PFGE分子分型可分为5种Not I-PFGE型13种亚型,相似性值为56%~100%。本研究结果为进一步探讨致病性霍乱弧菌的进化起源奠定了基础。     

饲料胆固醇含量对凡纳滨对虾免疫相关基因表达及耐低温低溶解氧胁迫能力的影响

为探究饲料中胆固醇含量对淡水养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)免疫相关基因表达及耐低温低溶解氧胁迫能力的影响,在鱼粉含量为10%的基础饲料中分别添加0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/kg的胆固醇,制成5组等氮等能饲料(C0、C1、C2、C3和C4,实测胆固醇含量依次为0.78、1.57、2.45、3.43和4.18 mg/g)投喂初始体质量为(0.14±0.03) g的凡纳滨对虾。养殖8周后检测对虾耐低温和低溶解氧胁迫的能力以及急性感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后免疫相关基因(Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA)相对表达量。结果表明:饲料胆固醇含量显著影响弧菌急性感染后对虾鳃组织Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA相对表达量。在弧菌感染进程中,C2组对虾Toll受体和溶菌酶的mRNA表达量表现出最大的变化幅度;而IMD mRNA表达量最大变化幅度出现在C1组,其次为C2组。急性感染弧菌后各组对虾Toll受体和溶菌酶mRNA相对表达量峰值均出现在感染后24 h;C2、C3和C4组IMD mRNA表达量峰值出现在感染后24 h,而C0和C1组IMD mRNA表达量峰值出现在感染后42 h。急性程序降温胁迫下,C0和C4组对虾100%死亡的温度为15℃;而其他组对虾100%死亡的温度为14℃。急性低溶解氧胁迫下各组对虾的耗氧量和致死溶氧浓度无显著性差异。综上所述:在淡水养殖条件下,饲料中2.45 mg/g的胆固醇含量可以提高凡纳滨对虾的免疫灵敏性,而饲料中胆固醇含量为(1.57～3.43) mg/g时凡纳滨对虾表现出较好的抗低温胁迫能力。