河北苹果坏死花叶病毒的发生及近全基因组序列的测定与分析

为明确苹果坏死花叶病毒（Apple necrotic mosaic virus, ApNMV）在河北的发生及其基因组特性,本试验利用RT-PCR技术对河北保定两地ApNMV发病情况进行检测,然后通过高通量测序技术对带毒样本进行序列测定和分析。结果表明,河北农大果园‘红珍珠’‘锦锈红’‘信侬红’3个品种及保定唐县苹果实验基地富士品种ApNMV检出率分别为9.09%、18.18%、100%和65%。ApNMV阳性果树高通量测序结果显示,果树为ApNMV、苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV）、苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus, ASGV）和苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus, ASPV）复合侵染,ApNMV河北分离物（ApNMV-HB）的近全基因组序列包含RNA1～RNA3序列,GenBank登录号分别为OP019626、OP019627和OP019628。RNA1编码120 kD的甲基转移酶/NTP-binding解旋酶（MET/HEL）,RNA2编码97 kD的RNA聚...     

一株新城疫病毒分离株全基因组序列的克隆与分析

根据GenBank上所公布的新城疫病毒(NDV)的全基因组序列,设计了10对引物,运用RT-PCR方法获取了三黄鸡新城疫病毒(SHJ00株)全基因组序列,并对其进行了比较分析。结果表明:此株三黄鸡新城疫病毒(SHJ00)的全基因组序列由15 192个碱基组成,在NP基因和P基因之间的非翻译区多了6个核苷酸ACACTC;与NDV一致,SHJ00基因由6个ORF组成,即3′-NP-P-M-F-HN-L-5′;测序后拼接的F基因长1 672 bp,包含完整的开放阅读框(1 662 bp),编码553个氨基酸,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,具有强毒株序列特性;根据NDV基因分型标准,三黄鸡新城疫病毒SHJ00株归属基因Ⅶ型新城疫病毒;F基因与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.9%~97.7%,其中与F48E9同源性为84.3%,与Lasota的同源性为82.0%;测序后拼接的HN基因长为1 716 bp,编码571个氨基酸,与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.0%~98.1%,其中与F48E9同源性为84.5%,与Lasota的同源性为81.4%。     

掌叶半夏凝集素基因表达载体的构建与鉴定

从掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott)块茎中提取总RNA,反转录合成cDNA.根据GenBank中已报道的天南星科凝集素基因序列,设计带有酶切位点的表达引物,用RT-PCR方法扩增出掌叶半夏凝集素(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA)基因.PPA经双酶切后与表达载体pGEX-6P-3连接,构建pGEX-PPA重组表达载体.通过PCR、双酶切及测序鉴定,结果表明,重组载体pGEX-PPA构建成功,为进一步进行PPA的原核表达及其功能研究奠定了基础.     

掌叶半夏疫病病原菌的分离与鉴定

为明确引起掌叶半夏疫病的病原菌,本研究对河北省安国地区掌叶半夏疫病株进行了病原菌的分离纯化、致病性测定以及病原菌的形态学观察和rDNA-ITS序列鉴定。从发病植株上分离得到了疫霉菌、镰刀菌、链格孢菌等几种候选病原菌,健康植株在接种疫霉菌菌株后,出现了与田间病株相似的症状。该疫霉菌株最高生长温度为36℃,异宗配合,孢子囊有明显的一个乳突,脱落孢囊柄平均长度约为2.9μm,其rDNA-ITS序列比对结果与寄生疫霉(Phytophthora parasitica)同源性为99%。结合以上结果,最终确定引起掌叶半夏疫病的病原菌为Ph.parasitica。     

掌叶半夏和东北天南星根尖色体观察

掌叶半夏和东北天南星在中药中常混称为天南星。本文从细胞学方面研究证明,二者根尖用铁矾—苏木精染色,染色体有明鲜差异,掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott)2n=26,东北天南星(Arisaema amurense Maxim.)2n=56(首次报道)。为植物细胞分类学、遗传学研究及植物育种工作提供理论依据。     

全基因组重测序在大豆育种上的研究进展

大豆是世界上最重要的油料作物之一。随着基因测序技术的快速发展及广泛应用,大豆育种研究受到了深刻的影响。本文简述了基因测序的主要方法及全基因组重测序在大豆育种、遗传转化研究中的应用,综述了目前全基因组重测序从发现突变位点、揭示进化关系、挖掘功能基因等基因功能和结构的角度,来研究大豆育种及疾病发生过程中的分子机理,为今后基因测序技术在大豆育种中的研究与应用提供参考。     

犬细小病毒河南株的分离鉴定及全基因组序列分析

为了研究河南省当前犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的流行情况,收集经CPV胶体金试纸检测阳性的病犬血便病料,对其处理后进行特异性PCR扩增,然后将粪便处理物经滤器过滤后接种于F81细胞,进行细胞盲传并观察细胞的病变情况,同时对病毒进行理化性质及血凝试验等检测,最后对病毒的全基因组进行测序。结果表明,该病毒经特异性PCR扩增初步鉴定为CPV,接种于F81细胞盲传2代后,出现明显细胞病变。全基因组测序显示,该病毒分离株基因组全长5 052 bp,其中包含U型发卡结构188 bp,Y型发卡结构120 bp。此外,其ORF1全长2 007 bp,能够编码非结构蛋白NS1,ORF2全长2 257 bp,能够编码结构蛋白VP1、VP2。经VP2氨基酸序列分析,鉴定其为New CPV-2b亚型,命名为CPV/HN1,该病毒分离株TCID_(50)为10~(-4.85)/0.1 mL,血凝效价为1∶256。与国内的17株参考毒株全基因组序列核苷酸同源性为96.4%～99.9%,其中与北京分离毒株同源性为99.9%。     

一株鲤春病毒血症病毒SVCV-shlj4全基因组序列分析

为了分析中国北方地区现行的一株鲤春病毒血症病毒(Spring Virernia of Carp Virus,SVCV)SVCV-shlj4全基因组序列,根据GenBank收录的SVCV参考毒株(SVCV-A2,DQ491000.1)基因序列设计了3对重叠引物,对SVCV-shlj4毒株基因组编码区进行扩增,利用RACE试剂盒对该基因组5′和3′非编码区(Untranslated region, UTR)进行扩增,并利用DNAstar软件对测得的序列进行拼接,获得完整的SVCV-shlj4全基因组,结合Lasergene及MEGA 5.1生物信息学软件对该病毒基因组及其编码的核蛋白、糖蛋白和磷蛋白基因序列进行系统进化分析。结果表明:SVCV-shlj4毒株基因组全长为11 029 bp,共编码5种结构蛋白(3′端-5′端),分别为核蛋白(Nuclear protein,N)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Matrix protein,M)、糖蛋白(Glycoprotein,G)和RNA聚合酶(RNA polymerase,L);基因组序列系统进化分析显示,SVCV-shlj4毒株与中国株SVCV-A2的核苷酸序列一致性最高(99.0%),与欧洲株VR-1390核苷酸序列一致性最低(93.0%);编码M蛋白、G蛋白和P蛋白的基因序列进化分析结果显示,SVCV-shlj4毒株在进化上处于亚洲分支,属于Ⅰa基因型,Ⅰaii基因亚型;SVCV-shlj4毒株各基因变异位点分析显示,与中国株SVCV-A1相比,SVCV-shlj4毒株在N基因编码区第1357、1364和1376 nt位点分别缺失1个碱基,在G基因3′端非编码区4630 nt位点和4639 nt位点分别缺失两段基因序列(44 bp和31 bp),与欧洲株VR-1390相比,SVCV-shlj4毒株在G基因3′端非编码区(4637 nt位点)插入10 bp的基因片段,与中国株BJ0505-2相比,SVCV-shlj4毒株在L基因编码区(5822 nt位点)缺失18 bp碱基。本研究系统地分析了中国北方地区现行SVCV分离株的分子特征,为SVCV分子进化研究提供了数据支撑。     

减蛋综合征病毒NE4株全基因组序列测定与分析

根据减蛋综合征病毒(EDSV-76)AV-127株的全基因序列(序列号BK000404),用Premier5.0软件设计22对引物,利用PCR方法对EDSV-76病毒NE4株的全基因组进行了分段扩增、克隆和序列测定,并用DNAStar分析软件对各片段的测序结果进行拼接,将该序列与GenBank中已登录的相应序列进行同源性分析,并用六邻体蛋白构建进化树.结果表明:NE4株基因组序列全长33214bp,GC含量为43%,与国际标准株AV-127相比,核苷酸序列同源性为99.6%.碱基的插入或缺失主要在非编码区,在100K蛋白编码区距羧基端1/10处插入了1个碱基C,其ORF编码696个氨基酸,而AV-127株100K蛋白编码709个氨基酸,预计其发挥功能的基团在N端.蛋白同源性分析表明,EDSVNE4株主要蛋白与羊腺病毒OAV(Ovine adenovirusD)、牛腺病毒BAV(Bovine adenovi-rusD)和蛇腺病毒SAV(Snake adenovirus)有较高的同源性,而与禽腺病毒Ⅰ群(CELO)的同源性较低,说明NE4株与禽腺病毒Ⅰ群亲缘关系较远,进化树分析也证实了此特性.     

35株非洲猪瘟病毒全基因组序列的系统生物学分析

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)源于非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)感染所引起的烈性传染病,主要是以蜱和野猪为天然宿主。ASFV感染能够导致家猪及野猪直接死亡,死亡率近乎100%。目前在非洲、欧洲、亚洲等地区均出现大面积爆发,却尚未出现对该病毒进行预防的商业化疫苗。因此,需要对病毒基因组信息有更深入的了解。通过对不同地区发生的ASFV全基因组进行多序列比对、系统进化树构建、保守区域检测等,获得与ASFV毒力、进化等相关的基因片段,并研究这些基因片段在不同区域的病毒株中的关系。结果表明:Ⅶ与Ⅱ基因型相比较,后者出现很多大片段基因序列的增加,这些增加的片段主要出现在V110、360、505/530多基因家族中。其中,对多基因家族中MGF 505/530-7R、MGF360-1L基因研究分析表明,不同基因型之间由于这些基因的差异影响巨噬细胞的存活能力、病毒复制强弱与病毒变异和进化有关,结果为研究病毒进化及未来病毒疫苗研发提供新的方向。     

抗CMV和ToMV RNAi载体的构建及加工番茄遗传转化

【目的】利用农杆菌介导法将抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12转入红番3号加工番茄,获得抗CMV和ToMV的加工番茄植株,为加工番茄病毒病的防治奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增,选取新疆加工番茄CMV分离物NS0-4 1a复制酶第1 051-1 350bp序列和ToMV分离物SCS-2 130/180ku复制酶第1 920-2 200bp序列,作为干扰片段CR12和To12。通过T克隆载体将CR12和To12连接成拼接片段TC12,构建成含反向重复结构拼接片段的RNAi表达载体pBi35STC12。通过农杆菌介导法,用其转化红番3号加工番茄,经过筛选、PCR检测得到转基因植株。【结果】成功构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,并用其转化番茄植株,从转化的1 500个愈伤组织中获得33株再生植株,利用PCR对再生植株进行检测,显示从33株再生植株中获得了19株转基因植株,转化率为1.26%。【结论】构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,用其转化红番3号加工番茄,获得了转基因植株。     

低温胁迫对黄瓜花叶病毒CMV-BG株系cp基因多态性的影响

研究了低温胁迫下黄瓜花叶病毒与三生烟互作后CMV cp基因序列的变化规律,并分析了植物RNA病毒的进化机制。用黄瓜花叶病毒北京甘蓝分离物(CMV-BG)侵染三生烟不同单株,置于不同温度条件下(常温和低温)培养30 d后,对CMV cp基因进行克隆、序列测定和多态性分析。结果表明,侵染低温组植物CMV的cp基因多态性(Pi=0.001 76)高于常温组(Pi=0.001 14),IFEL分析检测到低温组第48个氨基酸位点为正选择位点,初步表明低温胁迫有助于提高CMV-BG cp基因序列的多态性,温度胁迫是植物RNA病毒与宿主互作过程中基因序列变异的一种重要的作用力。     

黄瓜花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立检测香蕉中黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的实时荧光定量方法.【方法】根据CMV外壳蛋白(CP)保守序列设计了TaqMan实时荧光定量PCR特异性探针及引物,优化反应体系检测TaqMan探针实时荧光定量方法的灵敏度、特异性和重复性.【结果和结论】该方法检测灵敏度为4.2×102μL-1,比普通PCR高100倍,且与香蕉束顶病毒Banana bunchy top virus(BBTV)、香蕉线条病毒Banana streak virus(BSV)无交叉反应,特异性和重复性都较好.用实时荧光定量PCR检测14份田间香蕉样品有5份样品为阳性,进一步证明建立的实时荧光定量方法可用于香蕉CMV的检测.     

侵染蚕豆ClYVV的鉴定及其衍生的小干扰RNA的深度测序鉴定研究

对安徽省合肥市采集到的具有明显典型花叶症状的蚕豆叶片进行深度测序,鉴定到样品中存在三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus, ClYVV),并获得了ClYVV的完整基因组序列,随后通过直接测序扩增基因组区域获得完整的基因组ClYVV-HF。获得的ClYVV-HF基因组由9 585个核苷酸组成,不包括poly(A)尾巴。ClYVV-HF的全部核苷酸序列与之前报道的来自日本的分离株(AB011819、NC_003536)和来自韩国的分离株(KF975894)分别具有95.45%和95.10%的核苷酸同源性。进一步分析了ClYVV-HF衍生的小干扰RNA的表征。vsiRNAs的大小为21~22 nt,vsiRNAs的5' 末端碱基偏向于A / U。ClYVV-HF来源的小干扰RNA大多来源于其基因组链中的7个热点,其中5个热点以21 nt vsiRNAs为主。生物学实验表明,ClYVV可通过汁液摩擦接种多种豆科作物。这是有关中国ClYVV分离株全部核苷酸序列的首次报道。     

一种抗虫凝集素基因的分子克隆及对油菜的遗传转化

采用同源序列克隆方法,通过设计特异引物克隆甘肃西和半夏(Pinellia ternata)凝集素基因pta,为基因工程抗虫品种选育奠定基础。研究结果表明,克隆pta序列全长1 069bp,编码区804bp,编码268个氨基酸残基,预测的分子质量和等电点分别为29.1ku和7.77,功能区完整,GenBank登录号AY725425。构建35S启动子驱动的植物表达载体pBI-pta,通过农杆菌介导法转化烟草,获得14株卡那霉素抗性和PCR检测阳性植株。对其中7个株系的接种试验显示,蚜口密度抑制率为22.5%～89.4%,平均蚜口密度抑制率56.2%,说明该基因具有较好的抗虫功能。另外,优化针对综合性状优良的陇油2号品种的遗传转化体系,获得3株经分子鉴定的转基因遗传工程植株。     

生防蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus 905基因组测序及分析

为深入研究蜡样芽胞杆菌905(Bacillus cereus 905)的促生防病机制以及为进一步优化该菌株提供遗传学信息,采用454焦磷酸测序技术对B.cereus 905基因组进行了测序,并使用相关软件对测序数据进行了基因组拼接、基因功能预测与注释、基因本体分析(GO)、直系同源基因簇(COG)聚类分析以及共线性分析。结果表明:B.cereus 905基因组草图序列大小约为5.39 Mb,GC含量35.05%,由127个片段重叠群组成;该序列已提交GenBank数据库,登录号为LSTW00000000;分析发现菌株905的基因组与其他蜡样芽胞杆菌的基因组有显著的共线性关系;菌株905基因组中存在相当数量的与促生防病功能相关的基因。本研究通过对B.cereus 905基因组的测序为该菌株的优化提供了序列信息。     

来自安徽不同地区黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）cp 基因的分子进化分析

为了揭示黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)安徽分离物分子变异及系统进化情况,从安徽省5个地区采集感染CGMMV的葫芦科样本。提取感病样本总RNA,经RT-PCR扩增、克隆和测序,获得17个CGMMV分离物的cp基因序列。序列比对发现,17个CGMMV安徽分离物的cp基因核苷酸序列相似性极高,达98.4%~100%,与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物cp基因核苷酸序列相似性也非常高,达98.6%~100%,而与CGMMV西班牙分离物和俄罗斯分离物cp基因核苷酸序列相似性相对较低,为90.7%~92.6%。从构建的系统关系树可以看出,17个CGMMV安徽分离物与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物形成1个单独的分支,而CGMMV俄罗斯与西班牙分离物聚成另1个分支,说明来源于中国和东亚的CGMMV亲缘关系较近。     

2014年云南番茄、辣椒上番茄斑萎病毒属病毒与传毒蓟马的发生特点

通过对大田栽培的烟草及周边杂草释放捕食螨——巴氏新小绥螨(Neoseiulus barkeri),探究对西花蓟马(Frankliniella occidentalis)具有最佳防治效果的捕食螨施用方法。

烟草大田期分别施用1~3次巴氏新小绥螨,每次释放间隔15 d,每种释放次数下分别设置在烟草和杂草上同时释放、仅在烟草上释放以及仅在杂草上释放3种方式。通过对比分析巴氏新小绥螨不同释放次数和不同释放方式下西花蓟马的种群数量,评价巴氏新小绥螨对烟草上西花蓟马的防控效果。

不同方式释放巴氏新小绥螨均能不同程度降低烟草大田期西花蓟马的种群数量。在烟草和杂草上同时施用3次巴氏新小绥螨对西花蓟马种群数量的控制效果最好,且维持时间最长,最高相对防效为58.02%;施用2次的防治效果次之,最高相对防效为55.57%;而仅施用1次巴氏新小绥螨对西花蓟马的防治效果最差且维持时间最短,最高相对防效仅为49.96%。相同施用次数下,仅在烟草上施用巴氏新小绥螨对西花蓟马的防治效果略高于仅在杂草上施用,但两者无显著差异。

在烟草和烟田杂草上同时释放巴氏新小绥螨能较好地控制西花蓟马,且在烟草大田期至少同时在烟草和杂草上释放2次巴氏新小绥螨(间隔期约为15 d)才能达到相对较好的防治效果。在成本允许的情况下,巴氏新小绥螨释放次数越多,对西花蓟马的防控效果越好。

     

感染甘蔗花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库的构建及评价

为了研究甘蔗(Saccharum officinarum L.)与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)的互作机制,构建感染SCMV的甘蔗叶片的酵母双杂交cDNA文库。以热带种Badila为供试材料,提取感染SCMV植株的叶片总RNA,分离纯化获得mRNA,通过反转录反应合成3种读码框的双链cDNA。用Gateway技术,通过BP和LR反应,将cDNA迅速重组到酵母双杂交载体pGADT7-DEST上,构建酵母双杂交文库。结果表明,文库容量为2.0×107cfu,随机挑取24个克隆检测,重组率为100%,cDNA插入片段长度主要分布在1kb~2kb,文库质量较好。说明该文库的构建为筛选与SCMV互作的甘蔗寄主因子基因,研究甘蔗与SCMV的互作机制及甘蔗抗花叶病育种奠定基础。