尼罗罗非鱼清道夫受体基因Scara3的克隆及病原微生物刺激后的表达响应

为探究清道夫受体3(scavenger receptor class a member 3,Scara3)在尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus抵御病原微生物过程中的作用,采用聚合酶链式反应克隆得到罗非鱼Scara3基因,利用荧光定量PCR技术分析Scara3在健康尼罗罗非鱼组织分布及细菌、病毒感染后的表达情况,并进行亚细胞定位分析。结果表明：克隆得到尼罗罗非鱼Scara3基因cDNA全长序列为3 889 bp,开放阅读框(ORF)为1 827 bp,编码608个氨基酸,具有跨膜结构域和胶原(Collagen)结构域;多序列比对发现,Scara3氨基酸序列在脊椎动物中相对保守;亚细胞定位显示,Scara3蛋白在全细胞分布;荧光定量PCR分析显示,Scara3基因在健康罗非鱼各组织中均有表达,在血液、肠道、皮肤和胸腺等组织中表达量较高且显著高于其他组织(P<0.05);经脂多糖(LPS)、灭活无乳链球菌Streptococcus agalactiae和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激罗非鱼头肾白细胞后,Scara3表达量显著上调(P<0.05),经灭活无乳链球菌和Poly I:C刺激后,肠道、头肾和皮肤组织中的基因表达量表现出时序性。研究表明,尼罗罗非鱼在对细菌和病毒感染的免疫反应活动中,Scara3基因起着重要作用,本研究结果为后期硬骨鱼类中Scara3基因的功能研究提供了科学参考。     

尼罗罗非鱼清道夫受体基因Scara3的克隆及病原微生物刺激后的表达响应

为探究清道夫受体3(scavenger receptor class a member 3,Scara3)在尼罗罗非鱼Oreochromis nilotic-us抵御病原微生物过程中的作用,采用聚合酶链式反应克隆得到罗非鱼Scara3基因,利用荧光定量PCR技术分析Scara3在健康尼罗罗非鱼组织分布及细菌、病毒感染后...     

尼罗罗非鱼CRTC2基因克隆及其表达规律分析

[目的]掌握尼罗罗非鱼活化环磷酸腺苷效应元件结合蛋白调节转录共激活因子2(CRTC2)基因的表达变化规律,并探究饥饿对其表达的影响,为研究尼罗罗非鱼CRTC2基因功能打下基础.[方法]采用RACE-PCR从尼罗罗非鱼肌肉组织中克隆CRTC2基因,对其进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析不同组织/器官中CRTC2基因的表达量.[结果]尼罗罗非鱼CRTC2基因全长6927 bp,其开放阅读框(ORF)2388 bp,5'端非编码区(5'UTR)343 bp,3'端非编码区(3'UTR)4196 bp,编码795个氨基酸,具有保守的CORC-N、CORC-M和CORC-C结构域.由基于CRTC2氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树可知,尼罗罗非鱼与红鳍东方鲀的亲缘关系最近.尼罗罗非鱼的白肌、红肌、心脏、脾脏、肝脏、肾脏、脑组织和肠道等8个不同组织/器官中均有CRTC2基因表达,但以脑组织和白肌中的表达量较高;与正常投喂的尼罗罗非鱼相比,饥饿7 d的尼罗罗非鱼白肌CRTC2基因表达无显著变化(P>0.05),但饥饿15 d后CRTC2基因表达显著上调(P<0.05).[结论]尼罗罗非鱼各组织/器官中CRTC2基因的表达具有一定规律性,长期饥饿会影响CRTC2基因表达,即CRTC2可能与糖代谢密切相关,直接或间接影响尼罗罗非鱼的能量吸收和代谢.因此,尼罗罗非鱼CRTC2基因可作为信号转导调控糖代谢的候选基因.     

吉富罗非鱼组蛋白酶B基因克隆及无乳链球菌感染后的表达分析

【目的】探究组蛋白酶B基因（CtsB）在吉富罗非鱼感染无乳链球菌前后的表达差异,为深入研究罗非鱼抗无乳链球菌感染的免疫应答机制及后续通过SNP分子标记/基因组编辑技术快速获得吉富罗非鱼抗病新品种提供科学依据。【方法】通过RACE克隆罗非鱼CtsB基因cDNA全长序列,使用SMART、Splign、MEGA v6.0、BoxShade及MegAlign等在线软件进行生物信息学及系统进化分析,并以实时荧光定量PCR检测吉富罗非鱼CtsB基因组织表达谱及无乳链球菌感染后CtsB基因的表达变化规律。【结果】吉富罗非鱼CtsB基因cDNA序列全长1746 bp,包括161 bp的5’端非编码区（5’-UTR）、592 bp的3’端非编码区（3’-UTR）及993 bp的开放阅读框（ORF）,共编码331个氨基酸残基。基于CtsB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,吉富罗非鱼与奥利亚罗非鱼的亲缘关系最近,而与鲤鱼、大菱鲆、牙鲆、半滑舌鳎等物种相距较远。CtsB基因在吉富罗非鱼的肝脏、脾脏、鳃、前肾、脑、肠道、皮肤和肌肉等组织中均有表达,且以鳃组织中的相对表达量最高,是其他器官组织的2.0～3...     

尼罗罗非鱼P2X4R基因克隆及原核表达分析

[目的]克隆尼罗罗非鱼P2X4R基因,并构建原核表达载体进行诱导表达,为深入研究P2X4R在鱼类中的生物学功能打下基础.[方法]利用PCR克隆尼罗罗非鱼P2X4R基因的3个片段(G1、G2和G3),拼接获得目的基因后连接pCold II载体构建pCold II-P2X4R重组质粒,再转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG进行诱导表达.分别采用SDS-PAGE和Western blotting检测分析重组蛋白P2X4R的表达情况,并运用生物信息学在线分析软件对其理化性质、糖基化位点、跨膜区域、亚细胞定位及信号肽等进行预测分析.[结果]克隆获得的尼罗罗非鱼P2X4R基因大小为1108 bp,与pCold II载体重组后转化BL21(DE3)感受态细胞获得的原核表达载体经IPTG诱导可表达获得目的蛋白,在IPTG 1.0 mmol/L、37℃诱导4 h的条件下重组蛋白表达量高于在IPTG 0.1 mmol/L、16℃过夜诱导的表达量.重组蛋白P2X4R的分子量约43.0 kD,其氨基酸数量为354个,理论等电点(pI)为6.78,不稳定指数为37.62,属于稳定蛋白,脂肪族指数为74.35;重组蛋白P2X4R具有3个N-糖基化位点和1个O-糖基位点;该蛋白未见跨膜区,其蛋白几乎100%位于细胞膜内,不含信号肽.[结论]诱导表达获得的尼罗罗非鱼P2X4R蛋白具有3个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点,推测其存在糖基化现象,可制备相应抗体用于揭示罗非鱼巨噬细胞的抗原呈递作用机制.     

罗非鱼无乳链球菌C5a肽酶的克隆及原核表达质粒构建

为进一步了解无乳链球菌表面蛋白C5a肽酶scpB基因免疫表位及毒力作用基团的相关信息,通过提取罗非鱼无乳链球菌基因组DNA,利用特异性引物PCR扩增出scpB基因的全长开放阅读框(ORF)。结果表明,该基因包括3 405 bp的ORF,可编码1 134个氨基酸,与已报道的人源无乳链球菌ScpB的氨基酸同源性达99.74%。利用生物信息学软件DNAstar、Clustal X 2.0和MEGA 5.05及在线分析工具ExPASy ProtParam、NCBI Proten blast及Conserved Domain等对推导的氨基酸序列进行分析,结果显示罗非鱼无乳链球菌scpB基因编码的氨基酸序列含有3个催化三联体(catalytic triad)位点、7个假定活性位点(putative active site)、2个特异位点(specific hits),以及4个超家族结构（2个肽酶超家族结构Peptidases-S8-S53 superfamily、1个类纤连蛋白超家族结构 DUF1034 superfamily和1个鞭毛钩蛋白超家族结构FlgD-lg superfamily）;并且该氨基酸序列有多个抗原表位,推测ScpB蛋白应具有较强的免疫原性,可作为候选的蛋白疫苗成分。将该片段插入原核表达载体pET32a(+),转入大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆,经PCR、酶切及测序鉴定表明成功构建原核表达载体pET32a(+)/scpB。     

马波沙星在罗非鱼体内的药物代谢动力学研究

【目的】研究马波沙星在罗非鱼Oreochromis niloticus体内的药物代谢动力学(简称药动学)特征,为临床合理用药提供参考。【方法】将罗非鱼随机分成2组,水温维持在30℃,以10 mg·kg-1分别单剂量肌内注射和口服给药,高效液相色谱(HPLC)-荧光检测法测定血浆中马波沙星的质量浓度,用Win Nonlin 6.1药动学软件的"非房室模型"分析药动学参数。【结果】肌内注射马波沙星后,药物吸收和消除均较口服快,体内分布广泛。达峰时间(tmax)为0.25 h,峰质量浓度(ρmax)为4.31μg·mL~(-1),消除半衰期(t1/2λz)为19.21 h,表观分布容积为3.94L·kg-1,药-时曲线下面积(AUC)为70.36μg·mL~(-1)·h-1。口服马波沙星后,药物吸收和消除均较慢,体内分布广泛。tmax为4.00 h,ρmax为2.45μg·mL~(-1),t1/2λz为22.67 h,表观分布容积为4.27 L·kg-1,AUC为76.66μg·mL~(-1)·h-1。【结论】10 mg·kg-1马波沙星能够有效治疗大多数敏感菌引起的罗非鱼感染。     

伊维菌素在吉富罗非鱼体内的药物动力学

【目的】研究伊维菌素(IVM)在吉富罗非鱼体内的药物动力学,为其在罗非鱼养殖中的合理应用提供依据。【方法】将吉富罗非鱼按1mg/kg的给药剂量肌肉注射IVM,采用高效液相色谱法于给药后不同时间点对各组织进行采样检测,通过DAS 3.0药物代谢动力学软件分析IVM在吉富罗非鱼体内的药代动力学参数。【结果】在肌肉注射给药方式下,吉富罗非鱼血液中IVM质量浓度C随时间t的药物动力学模型符合一级吸收二室开放模型,其药物动力学方程为:C血液=0.215e-0.016(t-0.22)+0.198e0-0.413e-1.294(t-0.22)。肌肉注射给药后,IVM在血液及肌肉、肾脏、精巢和肝脏的峰含量(Cmax)分别为0.424mg/L及0.757,0.618,0.571,1.514mg/kg;达峰时间(Tmax)分别为8,24,8,16和24h;AUC(0-∞)分别为506.134,89.445,143.794,99.824和507.977mg/(L·h);MRT(0-∞)分别为1 810.979,176.789,194.868,312.487和259.84h;t1/2z分别为1 208.304,155.129,67.049,231.330和165.918h;各组织的药物代谢动力学方程分别为:C肌肉=4.219e-0.037t+0.217e-0.004t-4.436e-0.049t;C肾脏=0.001e-0.005t+0.713e-0.004t-0.714e-0.031t;C精巢=3.479e-0.096t+0.25e-0.003t-3.729e-0.119t;C肝脏=1.764(e-0.004t-e-0.132t)。【结论】IVM在吉富罗非鱼体内的药物动力学特征表现为:吸收快、分布广、消除缓慢。因此初步确定在水温(26±1)℃下肌肉注射1mg/kg IVM,其休药期为25d。     

温度对吉富罗非鱼呼吸的影响

在10-30℃条件下,测定呼吸室内吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT)呼吸频率、水体溶解氧、pH、游离二氧化碳以及氨氮的变化。结果表明,吉富罗非鱼耗氧率(Y_cr)和排氨率(R_an)随着温度(t)的升高而增大,线性回归方程分别为Y_cr=0.0038t²-0.0023t+0.0312(R²=0.9549),及R_an=0.0009t²-0.0027t+0.0037(R²=0.9475);氨熵(Q_a)为0.065-0.099(<0.33),蛋白质供能比为5%~30%,表明吉富罗非鱼主要由脂肪和碳水化合物供能。当温度在15~30℃时,随着温度的降低,二氧化碳排放率从0.0684mg/(g·h)下降至0.0114mg/(g·h)。出水pH明显低于进水pH,且进出水口pH的降低幅度随温度升高而增大。试验期间,10~30℃的呼吸商(Q_r)为0.55±0.10(<1),吉富罗非鱼主要进行有氧呼吸。     

光照周期对尼罗罗非鱼幼鱼昼夜节律调节的作用

为了研究尼罗罗非鱼幼鱼游泳行为在不喂食时是否存在昼夜节律和光照周期的调节作用,设计了光周期为光照(L)∶黑暗(D)=12 h∶12 h,持续的黑暗(DD),持续的光照(LL),光周期为L∶D=6 h∶6 h和光周期为L∶D=2 h∶2 h。结果表明:(1)光周期为L∶D=12 h∶12 h时,尼罗罗非鱼具有明显的昼夜节律,昼夜节律周期为(24. 3±0. 2) h;(2)尼罗罗非鱼的昼夜节律在持续的黑暗和光照下仍然存在,分别为(25. 1±1. 1) h和(25. 6±1. 0) h;(3)光周期为L∶D=6 h∶6 h时,尼罗罗非鱼仍具有明显的昼夜节律(12. 6±0. 5) h;(4)在光周期为L∶D=2 h∶2 h时,尼罗罗非鱼的昼夜游泳行为仍具有明显的昼夜节律,节律周期为(4. 0±2. 0) h。这些结果表明,尼罗罗非鱼具有以24 h为周期的内源性生物钟,但相比与外源性光照调控,内源性的生物钟对罗非鱼的调控较弱,外源性的光照周期才是调节尼罗罗非鱼幼鱼昼夜行为节律的主要因素。     

环磷酰胺诱导的尼罗罗非鱼体内外肝损伤模型的构建

以环磷酰胺(CTX)为诱导物，建立罗非鱼体内外急性肝损伤模型。体外，0、5、10、15、20和25 mmol·L^-1 CTX 分别作用于离体培养的罗非鱼精密肝切片（PCLS）6 h 后，测定切片培养上清中谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）和乳酸脱氢酶（LDH）水平，同时收集肝切片，用噻唑蓝（MTT）法检测肝切片增殖活性，测定切片内总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、过氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）水平。体内，采用胸腔注射法造模，每千克鱼体重分别注射0、10、25、75和100 mg环磷酰胺（下文以mg·kg^-1表示），每隔3 d给药1次，连续3次。末次给药后第4天取血，测定罗非鱼血清中GPT、 GOT 和LDH及肝组织匀浆中T-AOC 、MDA、SOD和GSH水平。结果显示： 20～25 mmol·L^-1 CTX作用体外培养精密肝切片6 h及75～100 mg·kg^-1 CTX胸腔注射罗非鱼后，均可以导致GPT、GOT和 LDH 活力显著升高；T-AOC、SOD活力及GSH含量显著下降，MDA含量显著提高。同时，20 和25 mmol·L^-1 CTX能导致肝切片增殖活性显著下降，分别为空白对照组的67.29%和55.41%，且有剂量依赖性。结果表明：CTX可引起罗非鱼肝损伤；分别采用20 mmol·L^-1 CTX 作用体外培养PCLS 6 h或者采用75～100 mg·kg^-1 CTX胸腔注射罗非鱼，每隔3 d给药1次，连续3次，均可以构建体内外急性肝损伤模型。     

不同脱毒棉粕对尼罗罗非鱼幼鱼生长性能和生理代谢的影响

【目的】研究经硫酸亚铁和高温脱毒处理后的棉粕,以不同比例替代豆粕时对尼罗罗非鱼幼鱼生长、体内组织游离棉酚含量、体组成及血清转氨酶活性的影响。【方法】采用硫酸亚铁和高温2种方法对棉粕进行脱毒处理,以未处理及脱毒处理后的棉粕分别替代对照饲料中1/3和2/3豆粕,共配制7组等氮、等能的饲料,饲养尼罗罗非鱼幼鱼(初始体质量(7.27±0.25)g)70 d,测定体质量增长率、饲料系数、鱼体营养成分、体内组织游离棉酚含量和血清转氨酶活性等指标。【结果】各组尼罗罗非鱼幼鱼的体质量增长率、特定生长率、成活率及鱼体粗蛋白和粗脂肪含量均无显著差异(P>0.05),未经脱毒处理棉粕替代2/3豆粕组的饲料系数显著高于其他组(P<0.05);各试验组鱼体的肝体比均较对照组显著升高(P<0.05),各组脏体比之间无显著差异(P>0.05)。未处理棉粕组肝脏游离棉酚含量显著高于其他组(P<0.05),经硫酸亚铁或高温处理后游离棉酚含量均显著降低(P<0.05);未处理棉粕组肌肉中的游离棉酚含量与对照组无显著差异(P>0.05),且脱毒处理替代2/3豆粕组肌肉游离棉酚含量较未处理棉粕替代2/3组分别降低了70.27%,82.43%(P<0.05)。未处理棉粕组鱼体血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性显著高于脱毒处理组(P<0.05)。【结论】在本试验周期内,饲料中棉粕替代豆粕量不超过2/3时,并不影响尼罗罗非鱼幼鱼的生长性能;替代量为2/3时,会降低尼罗罗非鱼对饲料的利用效率。饲料棉酚对鱼体肝脏和肌肉游离棉酚含量以及血清转氨酶活性有显著影响,可引起肝功能异常。利用硫酸亚铁和高温2种方法处理棉粕后,可以有效降低游离棉酚在饲料和体内的含量,提高棉粕的利用率,降低游离棉酚对肝脏的损伤程度。     

饲料中添加黄藤素对吉富罗非鱼生长性能、抗氧化能力和非特异性免疫的影响

为探究饲料中黄藤素含量对吉富罗非鱼生长、抗氧化能力和非特异性免疫的影响。在基础饲料中添加0(A组)、0.01%(B组)、0.02%(C组)、0.04%(D组)和0.08%(E组)的黄藤素,饲喂平均体质量为0.5g的吉富罗非鱼幼鱼12周。结果表明：（1）饲料中黄藤素的含量对罗非鱼摄食率、末重、日增重系数、饲料系数无显著影响（P>0.05）,E组体增重显著高于对照组(P < 0.05)。（2）随着黄藤素添加量的提高,血清中AKP、T-AOC活性呈上升趋势,其中以E组最高,D组SOD活性显著高于其它各组(P < 0.05),各试验组MDA活性均低于对照组。（3）随着黄藤素添加量的提高,肝脏中SOD、AKP、T-AOC、CAT活性随黄藤素添加量的提高呈上升趋势,E组GSH-Px活性显著高于其他各组(P < 0.05),各处理组MDA活性均低于对照组。（4）C组和D组LZM活性显著高于对照组(P < 0.05),D组巨噬细胞吞噬活性及基因IL-1β表达量显著高于对照组(P < 0.05),C组基因TNF-α表达量显著高于对照组(P < 0.05),血清补体C4活性呈上升趋势,以E组最高。结果表明：饲料中添加0.04%~0.08%黄藤素在维持良好生长性能的同时能有效提高罗非鱼抗氧化能力。     

尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交后代微卫星标记鉴别和种质纯度分析

从罗非鱼微卫星遗传图谱前6个连锁群上随机选取43个微卫星位点,对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、尼罗罗非鱼吉富品系(GIFT)、奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)以及尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼杂交后代的DNA进行PCR扩增,筛选出7个位点（UNH995、GM066、GM166、UNH162、GM017、GM440、UNH948）在不同罗非鱼中扩增的条带差别明显,具有特异性,可作为罗非鱼鉴定的分子标记,用其中任意一个位点都可以将尼罗罗非鱼或吉富罗非鱼、奥利亚罗非鱼、杂交罗非鱼区别开来。这7个标记位点在尼罗罗非鱼、吉富罗非鱼和奥利亚罗非鱼中平均每个位点检测到等位基因个数分别为3.1、2.3、1.7,等位基因大小在130～316 bp。这7个标记位点上,尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼PCR扩增的条带大小相差在20 bp以上,对其中2个位点扩增的条带进行测序分析,结果表明是由于微卫星重复次数的差异而造成的。用这7个位点对尼罗罗非鱼、吉富罗非鱼和奥利亚罗非鱼群体的种质纯度进行检测,结果表明,这3个罗非鱼群体中分别有8%、4%、4%的个体在有些位点上的谱带与杂交罗非鱼的相似,可能存在基因污染。     

谷胱甘肽对奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖及生化功能的影响

【目的】研究谷胱甘肽(Glutathione,GSH)对奥尼罗非鱼Oreochromis niloticus×O.aureus原代肝细胞增殖和生化功能的影响,探究谷胱甘肽的促生长作用机制。【方法】用添加φ为10%胎牛血清和未添加血清的培养液培养奥尼罗非鱼原代肝细胞48 h,随后在培养液中分别加GSH至0、30、100、300、900 mg·L~(-1),每个水平设6个重复,培养24、48和72 h后测定奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖情况及培养液中胰岛素样生长因子、白蛋白、过氧化氢含量和谷草转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶活性。【结果】谷胱甘肽显著促进了奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖,提高了培养液上清中胰岛素样生长因子、白蛋白的含量和γ-谷氨酰转肽酶活性,降低了培养液上清中过氧化氢含量和谷草转氨酶活性(P0.05)。在无血清培养试验组中添加谷胱甘肽,对奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖及生化指标的影响比添加血清培养试验组效果明显。【结论】谷胱甘肽能促进奥尼罗非鱼肝细胞增殖,且具有保护肝脏的作用。