马氏珠母贝NatF基因克隆及其表达分析

【目的】掌握马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）Nα-乙酰转移酶60基因（PmNatF）在不同组织、不同发育时期及不同病原相关分子模式（PAMPs）刺激下的表达变化规律,为后续研究NatF基因功能及揭示其在刺激应答中的分子机制提供理论依据。【方法】运用RACE克隆PmNatF基因cDNA序列,通过ProtScale、ProtParam、PSITE-Search、SignalP 4.1、SMART及Cell-PLoc 2.0 Package等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测PmNatF基因组织表达分布特征及其在不同发育时期和PAMPs刺激后的表达情况。【结果】PmNatF基因cDNA序列全长1142bp,其开放阅读框（ORF）为693 bp,5'端非编码区（5'-UTR）为181 bp,3'端非编码区（3'-UTR）为268 bp,共编码230个氨基酸残基。PmNatF蛋白分子量约26.64 kD,理论等电点（pI）为8.54,总平均亲水性系数为-0.068,为不稳定的亲水蛋白;PmNatF蛋白不存在信号肽和跨膜结构域,包含有N-乙酰转移酶结构域（Acetyltransf_1 domain）,其亚细胞定位于细胞质。PmNatF蛋白二级结构中,α-螺旋占36.52%,β-转角占6.96%,延伸链占22.91%,无规则卷曲占33.91%;其三维结构与太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）的NatF蛋白结构相似。PmNatF氨基酸序列与其他物种的NatF氨基酸序列高度同源,其中与美洲牡蛎（C.virginica）和欧洲大扇贝（Pecten maximus）的NatF氨基酸序列相似性较高,分别为76.52%和75.22%。PmNatF基因在马氏珠母贝各组织中均有表达,以在性腺中的相对表达量最高;在不同发育时期也均有PmNatF基因表达,其相对表达量以卵的最高,担轮幼虫的最低。在脂多糖（LPS）刺激下,马氏珠母贝鳃组织PmNatF基因表达呈上调趋势,于刺激24 h时达最高值;在肽聚糖（PGN）刺激下,至刺激6 h时出现明显的峰值;在聚肌胞苷酸（PolyI:C）刺激下,则在刺激72 h时出现峰值。【结论】PmNatF基因具有较高的保守性,在马氏珠母贝各组织及不同发育时期均有表达,尤其以性腺和卵的相对表达量最高,且经PAMPs刺激后在马氏珠母贝鳃组织中呈明显的差异表达,表明PmNatF基因可能参与马氏珠母贝生殖细胞的分裂和成熟及其免疫应答过程。     

马氏珠母贝多糖提取及其保湿性研究

以马氏珠母贝的内脏团为原料提取、分离和纯化多糖,将马氏珠母贝多糖与甘油、聚乙二醇(PEG-400)、丙二醇和1,3-丁二醇等常规保湿剂进行对比试验,结果表明其保湿性优于常规保湿剂。     

马氏珠母贝的化学成分与药理作用研究进展

通过查阅国内近20年相关文献,对马氏珠母贝化学成分及药理作用的研究成果进行综述,旨在为其进一步开发利用提供科学依据.     

马氏珠母贝ISSR-PCR反应条件优化

采用ISSR技术对马氏珠母贝进行PCR扩增,100个引物筛选出48个呈阳性反应的引物。对影响ISSR-PCR反应的Mg2+浓度、模板浓度T、aq酶浓度、引物退火温度和反应循环数进行了优化,并对甲酰胺对试验的影响进行了初步探讨。结果表明:优化的马氏珠母贝ISSR反应条件为①反应体系2.5μl 10×buffer,镁离子浓度1.5 mmol/L,Taq酶1.0 U,200 nmmol/L ISSR引物,模板浓度为50 ng/μl,2%甲酰胺,0.10 mmol/L dNTP,加双蒸水至总体积25μl;②反应程序预变性94℃,5 min;变性94℃,30 s;退火52℃,1 min;延伸72℃,2 min;39个循环;延伸72℃,7 min。     

马氏珠母贝的研究进展

综述了马氏珠母贝的遗传育种、插核育珠以及珍珠层的结构、成分和成因等方面的研究进展,以期为马氏珠母贝的进一步研究提供依据。     

马氏珠母贝外套膜细胞的超微结构观察

利用透射电镜对马氏珠母贝外套膜表皮细胞超微结构进行了观察。结果表明:表皮细胞可分为4种,即柱状表皮细胞、电子透明粒细胞、电子稠密粒细胞、凸细胞,它们在不同区域的分布、形态和数量变化与外套膜的功能分化密切相关,尤其是与贝壳组分的分泌有关。在邻近表皮的结缔组织中也分布着许多电子透明粒细胞和电子稠密粒细胞,它们可作变形运动穿越基膜进入表皮。     

马氏珠母贝精子低温保存主要影响因素的研究

采用二甲基亚砜(DMSO)和甘油作为抗冻剂,以海水或体液等为基础液,配制体积分数为6％、8％、10％和12％的抗冻保护液．将马氏珠母贝精液和抗冻保护液以1：2、1：5、1：10和1：20(体积比)混合后,置4℃中平衡30和60min,再于-18℃中冷冻4、24和72h,解冻后观察精子的活动状态和受精率．结果表明,抗冻剂种类、体积分数以及精液与保护液的比例对精子的活动状态有很大的影响;4℃的平衡时间对精子的存活率影响不显著,但对受精率却有明显的影响．在-18℃时,精液和抗冻保护液体积比1：20,DMSO体积分数为10％和12％的两组保存效果较好．精子存活率随着保存时间的增长而降低,但基础液的类型对精子受精率没有明显影响．     

马氏珠母贝杂交家系生长性状与遗传参数分析

【目的】探究不同杂交策略下马氏珠母贝二元杂交子代的生长性状和养殖存活情况,为广西马氏珠母贝群体杂交育种配套系构建及选择育种提供参考依据。【方法】以马氏珠母贝海选1号（H）自育F₄代群体和北海野生群体（Y）自繁F₁代群体为亲本,通过二元杂交构建36个正反杂交家系,并以H亲本和Y亲本的自繁群体F₁代分别构建对照群组（PH和PY）;各群组经海区养殖14个月后采集壳长（SL）、壳高（SH）、壳宽（SW）和体质量（BW）等数据,利用混合线性模型（动物模型）进行生长性状遗传参数估计。【结果】在H（♂）×Y（♀）杂交子代中,SL、SH、SW和BW的遗传力（h2）分别为0.241、0.149、0.220和0.062,遗传相关系数（γ_g）范围为0.894~0.964,表型相关系数（γ_p）范围为0.558~0.865;在Y（♂）×H（♀）杂交子代中,SL、SH、SW和BW的h2分别为0.110、0.156、0.121和0.067,γ_g范围为0.981~0.989,γ_p范围0.603~0.881;2个杂交子代的生长性状表现为中低遗传力,且遗传相关高于表型相关。Y（♀）和Y（♂）群体的一般配合力（GCA）较高,说明更适合用于杂交配套;H（♂）×Y（♀）杂交子代中SL、SH和SW的特殊配合力（SCA）相对较高,且均为中低遗传力。在2个杂交子代中,4个生长性状的杂种优势分别为-0.02%~2.82%和-0.03%~0.27%,均以SL的杂种优势最高、SW的杂种优势最低。在H（♂）×Y（♀）杂交子代中SL、SH和BW等3个生长性状的杂种优势家系率为50.00%~72.22%,优势家系选择率≥50.00%;养殖存活性状的超亲优势家系率为19.44%,杂种优势家系率为61.11%,2个杂交子代和PY群体均表现出优势存活性状。【结论】H（♂）×Y（♀）杂交子代具有生长性状优势,Y（♂）×H（♀）杂交子代具有存活性状优势,2个杂交子代均存在综合杂种优势,可进行一般杂交育种应用;北海野生群体亲本的GCA较高,其SL和SH的遗传力及与BW的遗传相关也相对较高,在进行广西马氏珠母贝群体杂交制种时可考虑以野生群体子代作为专门化亲本来源,且对2龄亲本性状选择上宜优先考虑SL和SH。     

大珠母贝组织蛋白酶B基因克隆及其表达分析

【目的】分析组织蛋白酶B基因（CatB）在大珠母贝（Pinctada maxima）不同组织中的表达模式,明确CatB在大珠母贝中的功能作用,为培育生长快且抗逆性强的大珠母贝提供基础资料。【方法】利用RACE克隆大珠母贝CatB基因,利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、NPS@SOPMA、SWISS-MODEL及SignalP 4.1等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测CatB基因在大珠母贝外套膜（套膜区、边缘膜区和中央膜区）、肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等组织中的表达情况。【结果】大珠母贝CatB基因cDNA序列全长1365 bp,其开放阅读框（ORF）1026 bp,5'非编码区（5'-UTR）长度81 bp,3'非编码区（3'-UTR）长度258 bp,共编码341个氨基酸残基。大珠母贝CatB蛋白分子量为37.73 kD,理论等电点（pI）为6.66,脂溶性系数为67.48,不稳定指数为31.18,亲水性平均系数（GRAVY）为-0.451,为稳定的亲水性蛋白;在第89~337位氨基酸存在一个Pept-C1结构域。大珠母贝CatB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占51.03%,α-螺旋占26.98%,β-转角占9.09%,延伸链占12.90%;三级结构与马氏珠母贝（P.fucata martensii）CatB蛋白结构相似。大珠母贝CatB氨基酸序列与马氏珠母贝CatB氨基酸序列（ADX32985.1）的相似性高达90.91%;与长牡蛎（Crassostrea gigas,XP_011428258.1）、海湾扇贝（Argopecten irradians,ANG56311.1）、褶纹冠蚌（Cristaria plicata,AEF32260.1）的CatB氨基酸序列相似性分别为79.47%、65.38%和62.18%。CatB基因在大珠母贝外套膜的套膜区、边缘膜区和中央膜区及肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等7个组织中均有表达,以肝胰腺中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.05）,其次是外套膜的套膜区和中央膜区。【结论】CatB基因在大珠母贝肝胰腺中高表达,其次是外套膜的套膜区和中央膜区,故推测CatB是通过参与大珠母贝的消化吸收作用而调控其生长代谢过程。     

合浦珠母贝选育组和对照组生长性状相关分析

收集合浦珠母贝(Pinctada martensii)F4选育组和对照组不同月龄生长数据,对壳长、壳高、壳宽和体质量进行相关和回归分析。结果显示,各月龄选育组和对照组生长性状间相关系数均达到极显著水平(P0.01),相关系数范围分别为0.47~0.88和0.44~0.92。除选育组6月龄壳宽与其他性状间相关系数大于对照组相应数值外,选育组生长性状间相关系数均小于对照组。各月龄选育组和对照组估算体质量的多元回归均达到显著水平(P0.05),方程判定系数(R2)范围分别为0.625~0.848和0.745~0.902,选育组方程判定系数均小于对照组。该研究结果为合浦珠母贝选择育种工作中确定重要目标性状提供了理论指导。     

玉米赤霉素受体基因ZmGID1a的克隆及功能研究

为研究赤霉素(GA)受体GID (gibberellin insensitive dwarf),克隆编码玉米GID的同源基因ZmGID1a,分析其在物种间的保守性和系统进化关系。通过实时定量PCR分析该基因在玉米中的表达特性以及不同激素对该基因表达水平的影响。亚细胞定位确定蛋白在细胞核和膜上,利用酵母双杂技术分析Zm GID1a与GA负调控因子玉米DELLA-8和DELLA-9的互作。还分析了表达Zm GID1a转基因烟草的生理指标。这些结果表明Zm GID1a和其他已报道的同源蛋白功能相似。     

东亚钳蝎对小菜蛾的捕食效应

在实验室条件下，研究东亚钳蝎对小菜蛾的捕食效应。结果表明，东亚钳蝎对小菜蛾3~4龄幼虫及成虫的捕食功能反应属于Holling 功能反应模型Ⅱ型，对幼虫和成虫的瞬间攻击力分别为0.661和0.687，最大捕食量则分别为36.36头和125头。东亚钳蝎有较强的种内干扰作用，随着捕食者密度的增大，捕食作用率相应降低。猎物和天敌相互干扰会降低东亚钳蝎对3~4龄小菜蛾幼虫的寻找效应，但对其捕食量影响不大。在小菜蛾幼虫和成虫的混合种群中东亚钳蝎偏嗜小菜蛾成虫。     

东亚钳蝎神经毒素基因BmKCT的克隆与表达

从蝎毒腺中提取总RNA,通过RT-PCR得到东亚钳蝎神经毒素BmKCT的cDNA,将其连接到pUCm-T载体中。序列分析表明,该基因开放阅读框架编码59个氨基酸残基,其中24个为信号肽,其余35个为成熟肽,与Genebank上登录的相同。将蝎神经毒素cDNA再经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pTrcHisA表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导可高效表达分子质量为10ku左右的融合蛋白。表达产物约占菌体总蛋白的25%。     

火龙果HpGST基因克隆及表达分析

为探究火龙果（Hylocereus）谷胱甘肽S-转移酶基因（HpGST）的功能,克隆了HpGST基因的cDNA序列,并进行生物信息学及表达分析。结果显示：HpGST序列全长为666 bp,编码221个氨基酸,编码蛋白属于非分泌型不稳定亲水性蛋白,亚细胞定位预测其于细胞质中发挥作用;系统进化树显示其与藜麦亲缘关系较近,属谷胱甘肽转移酶Tau家族;实时荧光定量PCR分析结果显示,HpGST在火龙果不同色泽类型品种果肉中均有表达,在有色素累积的紫肉和粉肉类型中表达量均显著高于无色素累积的白肉类型,表达趋势均为先上升后下降,其表达量与甜菜素含量呈现正相关,且在不同色泽类型品种中表达趋势与甜菜素累积趋势高度一致,推测HpGST基因在火龙果甜菜素合成与分布中发挥重要作用。     

七彩神仙鱼Vasa基因cDNA的克隆及表达分析

源自DEAD-box家族的Vasa基因是生殖细胞的分子标记之一。本研究克隆了七彩神仙鱼（Symphysodon haraldi） Vasa基因的全长序列,并进行了不同组织的表达分析。结果表明：七彩神仙鱼Vasa 基因cDNA序列共2 370 bp,其中5''UTR占123 bp,3''UTR为279 bp,ORF编码655个氨基酸,长1 968 bp。氨基酸序列同源性分析表明七彩神仙鱼的Vasa基因与尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的同源性最高。半定量分析表明,Vasa基因在成熟七彩神仙鱼的性腺中特异表达,在其它组织中无表达信号。qRT-PCR结果显示,Vasa在七彩神仙鱼早期胚胎发育阶段及出膜后50日内均有表达。在受精卵至囊胚期阶段,Vasa基因表达持续增加,在囊胚期至孵化期阶段,表达持续降低。在仔鱼阶段,Vasa分别在25日龄和40日龄出现了最低和最高表达量。繁殖前后比较发现,繁殖前的精巢组织中Vasa表达量比繁殖后的表达量低,而卵巢恰好相反。本研究结果可为研究七彩神仙鱼的性分化、生殖细胞分子标记及其发育提供参考。     

白斑狗鱼StAR基因克隆及其表达分析

【目的】克隆白斑狗鱼（Esox lucius）类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR）基因（ElStAR）并分析其组织表达差异,为开展StAR基因生物学功能研究及揭示白斑狗鱼性腺发育机制提供基础资料。【方法】根据GenBank已公布的白斑狗鱼基因组测序结果（NC_047581.1）设计特异性引物,采用RT-PCR克隆ElStAR基因cDNA序列,通过ClustalX、ExPASy、TargetP 1.1、TMHMM 2.0和SignalP 5.0等在线软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR进行ElStAR基因组织表达定量分析。【结果】ElStAR基因cDNA序列长度1485 bp,其开放阅读框（ORF）为864 bp,共编码287个氨基酸残基;ElStAR氨基酸序列与北极红点鲑StAR氨基酸序列的相似性最高（93.33%）,与海鳟、条纹鲈鱼、金头鲷、大菱鲆、斑马鱼、半滑舌鳎的相似性均高于75.00%,而与小家鼠的相似性最低（59.15%）;基于StAR氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示白斑狗鱼与北极红点鲑和海鳟等鲑科鱼类处于同一分支。ElStAR蛋白相对分子量为32.23 kD,理论等电点（pI）为8.98,为不稳定的亲水性蛋白;具有START结构域,无信号肽及跨膜结构,符合线粒体靶向肽的基本特征。ElStAR蛋白二级结构由α-螺旋（占40.77%）、无规则卷曲（占35.89%）、延伸链（占18.12%）和β-折叠（占5.23%）组成,其三级结构是由α-螺旋配合多个β-折叠卷曲盘旋而成。ElStAR基因在白斑狗鱼精巢、卵巢、头肾、肝脏、肌肉及脑组织中均有不同程度的表达,且在精巢中的相对表达量极显著高于在卵巢中的相对表达量（P<0.01）,呈明显的性别二态性表达模式。【结论】ElStAR基因编码蛋白结构和功能十分保守,具有典型的START结构域,对胆固醇的运输和调节起重要作用。ElStAR基因在白斑狗鱼精巢及卵巢中的表达存在极显著差异,可能在维持白斑狗鱼精巢的发育形成中发挥重要作用。