禽流感新疫苗研制成功

据报道，中国最近研制成功H5N1亚型高致病性禽流感新型疫苗，它们能够彻底切断致命病毒向水禽、家禽及哺乳动物和人类的传播。中国国家禽流感参考实验室主任陈化兰说，特别针对H5N1亚型禽流感研制的两种新型疫苗最近已完全成功，并获国家批准使用。     

基因工程疫苗和动物克隆技术取得突破

我国在国际上第一个研制成功抗H5N1禽流感病毒的基因工程灭活疫苗和H5亚型禽流感重组禽痘病毒载体疫苗，自2005年批准生产以来，已在全国应用8.2亿只份。     

蛋鸡禽流感（H5）免疫效果的跟踪调查

自2004年以来,邹城市对禽流感（H5）实行强制免疫,并且免疫率100%,使用疫苗是重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗（H5N1,Re-5＋Re-4）。为了追踪H5亚型禽流感疫苗的免疫效果及其免疫抗体（HI）消长规律,探索本辖区H5亚型禽流感灭活疫苗（H5N1,Re-5＋Re-4）的免疫程序,     

禽流感防治取得系列成果

本项目研究人员采用重组DNA技术和反向基因操作技术，研制成功了“重组HSN1亚型禽流感病毒灭活疫苗”和“H5亚型禽流感重组禽痘病毒载体疫苗”2种疫苗。疫苗高度安全、抗原针对性强，免疫效力高、持续期长，能够对各种禽流感提供有效保护；并且还研制成功了具有国际先进水平的“H5、H9亚型禽流感灭活疫苗”；建立了RT—PCR和抗原捕捉ELISA等快速诊断技术。     

不同类型H5亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究

为比较以我国首个H5亚型禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/1996(H5N1)\[GS/GD/96\]为基础构建的新型重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）的免疫保护效力。分别将四种禽流感疫苗以2.8 μg HA/0.3 mL（肌肉注射）、103PFU/100 μL（刺种）、106EID50/100 μL（滴鼻、点眼）、15 μg/200 μL（肌肉注射）等不同剂量和方式免疫3周龄SPF鸡,首次免疫3周后再加强免疫一次,加强免疫2周后用106EID50的高致病力禽流感病毒（HPAIV） GS/GD/96鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况。分别于攻毒后第3 d、第5 d、第7 d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫及攻毒后血清HI抗体的动态变化。所有疫苗均可对免疫鸡形成100%完全保护（不发病、不致死、不排毒）;在病毒攻击前,灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）所诱导的HI抗体平均水平分别为875log2、6.5log2、5.13log2和7.88log2。新型的基因工程疫苗具有良好的免疫保护性,已经或将在H5亚型HPAIV的防治实践中起到有益的补充作用。     

陈化兰:H5N1亚型禽流感疫苗的研究及应用

1996年,我国首次在广东病鹅体内发现H5N1亚型高致病力禽流感病毒.其后,在有关主管部门的领导下,我国兽医科学工作者开展了大量的禽流感主动监测和研究工作.通过系统研究发现,我国H5N1禽流感分离株的抗原性存在相对保守性,为使用疫苗防治该病提供了重要理论依据.     

禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达

[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。     

HA基因138位点突变提高H5亚型禽流感疫苗候选株在鸡胚中的繁殖能力

目前,H5亚型禽流感疫苗的大规模生产仍使用鸡胚培养的重组病毒灭活疫苗.为加深对重组病毒在鸡胚中繁殖适应性分子机制的理解,并获得在鸡胚中的高产疫苗候选株,以反向遗传技术构建了H5亚型禽流感疫苗候选株SF/H5N1,并在鸡胚尿囊腔中连续传代.同时对第1、6、7和10代病毒的全基因组序列进行了分析和发生点突变片段的结构模拟.结果均表明,HA片段138位丙氨酸(A)向丝氨酸(S)的突变与重组病毒SF/H5N1在鸡胚传代过程中繁殖性能升高相关.对不同来源重组病毒LF/H5N1进行A138S突变,产生了相似的效果.并且,A138S突变未明显改变重组病毒的抗原性和对鸡胚的致病力.因此,A138S突变对H5亚型禽流感疫苗候选株的鸡胚适应性具有重要影响,在疫苗生产中具有应用价值.     

H5亚型禽流感研究势态——基于Citespace的文献计量分析

为准确把握H5亚型禽流感的研究进展，本研究基于CNKI文献数据库中的393篇文献和Web of Science(WOS)文献数据库中的1 560篇文献为研究样本，通过信息可视化技术对2个数据库中的文献样本的发文国家、文献数量、高频被引文献、高频关键词、主要发表作者和机构等进行分析。结果表明:1)国际上中国和美国在该领域的研究较多，两国发文量占比可达56.80%；每年文献数量与禽流感疫情的严重程度密切相关。与CNKI文献样本相比，WOS文献样本的文献数量、高频被引文献的被引频次更具有优势，并且WOS文献样本中发文机构之间和发文作者之间的合作更密切。2)高频被引文献和高频关键词在一定程度上反映了该领域的研究热点，主要包括野鸟导致H5亚型禽流感病毒的传播和进化；H5亚型禽流感的流行病学、致病机制和免疫疗法；重组疫苗、灭活疫苗和基于血凝素HA的广谱疫苗等新型疫苗研发；H5亚型禽流感病毒突发的防控措施等内容。本研究认为在未来疫情的长期监测与预测、病毒的快速检测技术和新型疫苗的开发等仍是研究热点，为H5亚型禽流感领域工作者提供参考价值。     

H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在杆状病毒中的表达及其免疫效力评估

旨在利用杆状病毒表达系统构建1株对高致病性H7N9亚型禽流感病毒(A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016)攻击后的家禽提供保护的候选疫苗株.用同源重组的方法构建1株表达H7N9亚型禽流感病毒(A/chicken/Shaoxing/5201/2013株)血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的重组...     

中国防治禽流感药物研究取得重大突破

由农业部新兽药工程重点开放实验室研制的防治禽流感新制剂时前在华南农业大学P3实验室完成了活鸡人工感染H5N1亚型禽流感病毒治疗临床试验。结果表明，从中药材中提取的金丝桃素剥人工感染的H5N1亚型禽流感家禽活体具有百分之百的治愈率，对H9N2亚型禽流感病毒也有一定的抑制作用。     

肉鸡与蛋鸡H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平调查

为了解养殖场家禽中H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平,通过血清学调查,应用血凝抑制试验(HI)的方法,对四川内江、山东济南、河南鹤壁、江苏扬州4个定点实验观测站负责的养殖场的鸡血液样本进行禽流感病毒抗体分析,其中包含2个肉鸡场和3个蛋鸡场。研究发现蛋鸡场通常免疫了H5、H7、H9(或H5与H9)亚型禽流感疫苗,而肉鸡场只免疫了H9亚型禽流感疫苗;蛋鸡场和肉鸡场都存在免疫禽流感疫苗后抗体水平低和无抗体产生的情况,从而导致免疫不合格或免疫失败。以上结果表明,应加强家禽养殖场对不同亚型禽流感疫苗的免疫以及免疫后的禽流感病毒抗体水平监测,以防免疫失败,从而预防禽流感的发生和流行。     

禽流感疫苗可能无效

为了预防禽流感,各国正大量采购和囤积相关疫苗。不过最新的科学研究显示,目前用来对付H5N1禽流感的一般性疫苗,可能无法有效对付病毒变异体。据《泰晤士报》报道,英国政府已订购200万到300万剂H5N1禽流感疫苗,且即将宣布中标生产这种疫苗的公司。不过在中国和东南亚研究禽流感     

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4 660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白...     

H9亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)变异快、传染性强,由病毒流行株制备而成的灭活疫苗达不到完全保护的效果,导致H9N2亚型禽流感时有发生。为研发具有广谱保护性的H9亚型禽流感疫苗,本研究利用生物信息技术,对H9亚型AIV HA基因序列进行分析,设计获得HA基因序列。将HA基因构建于杆状病毒表达系统,表达的重组HA蛋白血凝效价为1×2¹²,与不同分支H9亚型AIV阳性血清具有良好的交叉反应活性。将重组蛋白制备成疫苗(rHA疫苗)免疫10日龄雏鸡,免疫后28 d将不同亚分支的H9亚型AIV流行毒株115和YZ株分别以1×10⁶EID₅₀(半数鸡胚感染量)感染试验鸡,rHA疫苗组交叉保护效力明显优于商品苗组。本研究结果表明H9亚型禽流感广谱型亚单位疫苗具有较好的应用前景,可以用于防控H9 AIV感染。     

美禽流感疫苗在动物实验中显效

美国研究人员近日宣布，他们针对H5N1型高致病性禽流感病毒研制的疫苗，在动物实验中已显示了效力．这种疫苗不仅能预防H5N1型禽流感病毒，也能预防人类流感病毒和其他类型的禽流感病毒．     

人类感染禽流感临床症状

【人群篇】 人类感染禽流感临床症状 并不是所有的禽流感病毒都能引起禽流感，只有高致病性的毒株才能引发疫情。目前已发现能引起人感染禽流感的病毒，只有H5N1、H7N7、H9N2亚型毒株。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

猪对禽用禽流感H5N1基因重组灭活疫苗免疫应答

为评估猪对禽流感疫苗的敏感性、安全性和免疫效果,将63日龄育肥肉猪分为4组,按不同剂量进行禽流感H5N1亚型疫苗的免疫试验,其中第1、3组于首免后第21天按同样剂量进行二免。结果表明:试验猪首免后第10天能检出特异性禽流感抗体,随后抗体转阳率和抗体效价持续上升。二免试验组免疫反应优于一免试验组,而以第1组免疫效果最好。同时,采用荧光RT-PCR技术对试验猪的鼻拭样品进行H5亚型禽流感病毒的检测,结果均为阴性,表明目前使用的禽流感H5N1疫苗不会造成猪体带毒,使用安全。     

H5和H9亚型禽流感病毒反向斑点杂交同步检测法的建立

【目的】建立H5和H9亚型禽流感病毒的反向斑点杂交鉴别诊断方法。【方法】在H5和H9亚型禽流感病毒血凝素基因的保守区段内,选择设计2对引物,RT-PCR扩增后将目的片段克隆到pGEM-T载体中,得到重组质粒pGEM-T-H5与pGEM-T-H9。以重组质粒为模版,选择合成寡核苷酸探针与生物素标记引物。将探针通过紫外交联方法固定在带正电荷的尼龙膜上,用生物素标记引物扩增特异性片段,扩增产物经热变性后与探针进行杂交,杂交后显色,出现明显蓝紫色斑点的判定为阳性,无斑点判定为阴性。【结果】利用建立的反向斑点杂交方法检测,H5、H9亚型禽流感病毒的血凝效价分别可达到2-9.6和2-11.9,杂交特异性好,且2亚型间无交叉反应。【结论】建立了H5和H9亚型禽流感病毒的反向斑点杂交检测方法,该方法灵敏度高、特异性好,可以实现H5与H9亚型禽流感病毒的鉴别诊断。