草坪草高羊茅高温诱导抑制差减杂交文库的构建及其表达

为了深入研究草坪草对抗高温逆境的分子遗传机制,构建高羊茅在高温胁迫下相关的基因文库。研究以冷季型草坪草高羊茅为研究对象,在长期生理试验的基础上,通过构建高羊茅在高温胁迫下的SSH文库,挑选部分阳性克隆进行测序,并对所获得的差异基因序列进行分析,研究了在38℃/30℃(昼/夜)培养箱中进行高温胁迫6 h的高羊茅叶片和对照组高羊茅叶片的RNA差异。结果表明:试验得到的差减文库中大量组成型表达的基因已经被有效去除,使某些特有的差异基因得到了富集;两个文库的基因片段的长度分布在200~900 bp,平均片段长度约500 bp左右;在构建的高羊茅耐热cDNA文库中随机挑选了123个大小约500 bp左右的EST测序,共得到100个有效序列,其中38个是未知序列,其余62个为已报道序列,但是序列功能全部未知,这些EST中有25个与叶绿体染色体有关,其中9个与已提交的羊茅属植物叶绿体内的基因同源。本试验最终得到了合格的差减文库并对部分基因进行了测序,可为高羊茅耐热基因的研究提供依据,同时也为提高草坪草水肥调控措施提供了理论基础。     

打顶烟草根尖组织抑制性消减cDNA文库的构建及其序列分析

[目的]构建烟草打顶后根尖组织的消减文库,寻找调控烟碱生物合成的相关候选基因.[方法]以打顶株为测验子(tester)、以非打顶株为驱赶子(driver),利用抑制性消减杂交(suppression subtractivehybridization,SSH)和反向Northern杂交技术构建和筛选烟草打顶前后根尖组织消减文库,并对差异表达克隆进行生物信息学分析.[结果]构建了具有高消减效率的cDNA文库.PCR验证消减文库阳性克隆的插入片段为200-1 000 bp.经反向Northern杂交,从850个克隆中筛选到560个杂交信号差异明显的克隆,测序后得到273条有效序列.对273个已知功能基因的ESTs进行分类,生物碱合成类占4%、植物激素代谢类占3%、信号转导和转录因子类占18%、胁迫和防御类占32%、蛋白质代谢占9%,碳代谢占6%、其它代谢占15%,功能未知类占13%.RT-PCR结果显示,NTAT84和NTAT71序列在烟株打顶后转录活性均升高.[结论]应用SSH技术构建了烟草打顶前后根尖组织消减cDNA文库.     

干旱胁迫下多枝柽柳正反向消减cDNA文库的构建

以干旱处理和生长在土壤水分充足的多枝柽柳的叶片为材料,利用抑制性消减杂交技术（SSH）成功地构建了干旱处理与对照之间的正反向消减cDNA文库。琼脂糖凝胶电泳分析表明,消减前后的PCR产物电泳谱带差异明显,说明消减成功。经检测,文库克隆的重组率为95％,插入片段多数集中在0．2～0．5kb之间。对正向文库邵分克隆进行测序发现,文库中含有Mn—SOD、钙调蛋白、钙依赖蛋白激酶、脱水诱导蛋白等大量的抗旱相关基因,说明干旱胁迫下多枝柽柳抑制性消减文库已经构建成功。     

香蕉叶片低温胁迫下差异表达cDNA消减文库的构建

为了解析香蕉寒害的分子机理,应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractivehy bridization,SSH)成功构建了香蕉叶片在低温胁迫下与未处理的差异表达的cDNA消减文库,并通过经蓝、白斑筛选,克隆测序及序列分析,以及应用半定量PCR技术对随机选取的No.28基因片段进行表达分析等方法,初步分析了实验所构建的cDNA消减文库。结果表明,实验所构建的cDNA消减文库为低温胁迫特异表达的cDNA消减文库;测序及序列分析的结果暗示可能有相当多的未知功能基因参与了香蕉抗寒的过程;随机选取的No.28的表达分析检测结果证实,通过对构建的cDNA消减文库的全面分析,有可能获得一批低温胁迫诱导特异表达的新基因,尤其对其功能的深入了解,将为全面解析香蕉寒害的分子机理、寒害过程中的信号转导打下理论基础。     

灭多威胁迫下罗非鱼精巢SSH文库的构建

[目的]应用抑制消减杂交(SSH)技术,建立灭多威胁迫下罗非鱼精巢SSH正反向文库。[方法]以雄性罗非鱼为试验动物,采用抑制性消减杂交技术构建罗非鱼精巢组织在灭多威胁迫下的正反向SSH文库。试验共获得45条EST,成功注释25条,其中正向文库13条,反向文库12条。功能明确基因按功能可分为5类,其中催化活性、细胞相关基因表达上调,细胞过程、结构分子活性相关基因表达下调。整合素β1表达量上调,丝/苏氨酸蛋白激酶pim-3、Ca~(2+)-ATPase、Na~+-K~+-ATPase、核糖体蛋白L22表达下调。[结论]研究结果可为揭示灭多威对罗非鱼生殖毒性的分子机制奠定基础。     

抑制性消减杂交技术研究Cd~(2+)胁迫下星星草基因表达

通过对Cd2+胁迫下星星草抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)cDNA文库的分析,从正向和反向消减文库中筛选出33个特异表达的阳性克隆,26个镉胁迫诱导表达,7个为镉胁迫抑制表达。序列分析表明,有29个与数据库中有同源性,其中功能已知的25个,未知功能有4个,剩余4个为无同源序列的新基因。已知功能序列中,19个为胁迫后诱导表达,6个为胁迫后抑制表达,其中谷胱甘肽还原酶(GSR)基因、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)基因、细胞膜CP5蛋白基因和ABC家族蛋白基因等与星星草抗镉离子胁迫密切相关。     

绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析

 【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。     

巨型艾美球虫株间差异表达基因消减文库的构建和分析

为分离鉴定巨型艾美球虫上海株与南通株间免疫原性的差异表达基因,分别以巨型艾美球虫上海株孢子囊cDNA为驱动组,以南通株孢子囊cDNA为试验组,或相反,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过2轮杂交和2次PCR分别构建了2个抑制性消减文库.随机从2个消减文库中分别挑取96个克隆产物,经PCR鉴定上海株和南通株孢子囊消减文库的重组率分别为91%和94%,差异基因片段大小为250～1 000 bp.从每个文库中随机挑取30个阳性克隆测序,并进行同源性比较分析,结果表明:从上海株cDNA消减文库中获得了19个单一有效序列,其中15个为未知序列;从南通株cDNA消减文库中获得了16个单一有效序列,其中13个为未知序列.这些结果将为分离巨型艾美球虫新功能基因和进一步探索球虫抗原变异相关的分子机理奠定基础.     

应用抑制消减杂交技术克隆鼻咽癌转移调控基因

目的：分离并鉴定高低转移表型不同的人鼻咽癌细胞株差异表达cDNA序列,了解鼻咽癌转移抑制基因或具有抑制活性的核苷酸序列。方法：以具有高低转移潜能不同的人鼻咽癌细胞株为研究对象,应用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）和T／A克隆法构建差异表达cDNA消减文库,对差异表达的cDNA进行测序和生物信息学分析。结果：成功构建人鼻咽癌细胞克隆株差异表达cDNA消减文库,从随机测序10个克隆中获得6个在低转移鼻咽癌细胞株中高表达cDNA序列,它们都与已知的人类基因片段具有高度同源性。结论：应用抑制消减杂交技术,从一对具有高低转移表型差异的鼻咽癌细胞株中获得6条可能与肿瘤转移抑制相关的cDNA序列,它们可能在维持肿瘤细胞的稳定和抑制肿瘤转移中起重要作用。     

陆地棉显性无腺体近等基因系SSH文库的构建

[目的]应用抑制性消减杂交技术构建差异表达cDNA消减文库。[方法]以显性无腺体中棉所12（显无中12）和中棉所12（中12）提取棉花总RNA,以显无中12为驱动子,中12为检测子,利用SSH法建立差异表达cDNA文库进行克隆,并以NestedPcRPrimer1和2R对插入片段进行PCR扩增,分别以显无中12和中12总cDNA为探针进行反向Northern杂交,筛选差异表达克隆,进行序列相似性分析。[结果]通过建立差异表达cDNA文库共获得2280个克隆,通过反向Northern杂交共筛选363个差异表达克隆,测序后得到299个质量合格的EST序列,共56个重叠群,91个单拷贝。这些EsT所涉及的基因,主要是与代谢和次生代谢调节、生物合成、细胞凋亡、信号传导等有关联的cDNAs。[结论]SSH文库的构建和分析为显性无腺体形成相关基因的克隆和结构功能研究奠定了基础。