用核酸探针检测新城疫病毒的研究

用光敏生物素标记鸡新城疫ｃＤＮＡ制备核酸探针，经斑点杂交和碱性磷酸酶显色后，探针同该ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物，ＰＣＲ产物重组子和新城疫强，弱毒株呈现阳性反应，与ＩＢＶ，ＩＬＴ，ＭＧ和正常尿囊液等均呈阴性杂交反应，田间病料的杂交试验也表明该ｃＤＮＡ探针是且特异的检测方法。     

用核酸探针检测新城疫病毒的研究

用光敏生物素标记鸡新城疫ｃＤＮＡ，制备核酸探针，经斑点杂交和碱性磷酸酶显色后，探针同该ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物、ＰＣＲ产物重组子和新城疫强、弱毒株呈现阳性反应，与ＩＢＶ、ＩＬＴ、ＭＧ和正常尿囊液等均呈阴性杂交反应，田间病料的杂交试验也表明该ｃＤＮＡ探针是敏感且特异的检测方法     

制备K700bp成探针与美意和平湖两品系西蜂RAPD—PCR扩增产物及它们基因 …

Ｋ７００ｂｐ是高产蜜西蜂引物Ｋ（５’－ＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣ－３’），通过ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增出来的一个特有ＤＮＡ片段。然后将Ｋ７００ｂｐ制备成探针再与高、低产蜜西蜂的ＰＣＲ产物及它们的基因组进行杂交。结果Ｋ７００探针只与高产蜜西蜂的ＰＣＲ产物及其基因组杂交，证明Ｋ７００ｂｐ确实是高产蜜西蜂的一个特有ＤＮＡ片段。     

制备K700bp成探针与美意和平湖两品系西蜂RAPD-PCR扩增产物及它们基因组DNA分子杂交的研究

Ｋ７００ｂｐ 是高产蜜西蜂引物Ｋ（５’－ ＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣ－ ３’） ，通过ＲＡＰＤ－ ＰＣＲ 扩增出来的一个特有ＤＮＡ 片段。然后将Ｋ７００ｂｐ 制备成探针再与高、低产蜜西蜂的ＰＣＲ 产物及它们的基因组进行杂交。结果Ｋ７００探针只与高产蜜西蜂的ＰＣＲ 产物及其基因组杂交，证明Ｋ７００ｂｐ 确实是高产蜜西蜂的一个特有ＤＮＡ 片段。     

DIG—标记鸡传染性法氏囊病病毒cDNA探针的制备

用ＩＢＤＶ特异引物对ＩＢＤＶ ＲＮＡ进行逆转录和ＰＣＲ扩增。以低融点琼脂糖凝胶电泳法回收ＰＣＲ扩增带，经酚－氯仿纯化后，用ＤＩＧ标记制备ＩＢＤＶ ｃＤＮＡ核酸探针。斑点杂交试验证明，该探针能与ＩＢＤＶ不同毒株发生阳性杂交反应，敏感度为１ｐｇ。本实验制备的ＩＢＤＶ ｃＤＮＡ核酸探针不仅为ＩＢＤＶ的流行病学研究和分子生物学鉴定提供了敏感可靠的手段，而且也是核酸探针制备方法的一次探索。     

DIG－标记鸡传染性法氏囊病病毒cDNA探针的制备

用ＩＢＤＶ特异引物对ＩＢＤＶＲＮＡ进行逆转录和ＰＣＲ扩增。以低触点琼脂糖凝胶电泳法回收ＰＣＲ扩增带，经酚－氯仿纯化后，用ＤＩＧ际记制备ＩＢＤＶＣＤＮＡ核酸探针．斑点杂交试验证明，该探针能与ＩＢＤＶ不同毒株（ＳＴＣ、Ｌｕｋｅｒｔ、Ｂ＿２和ＬＱ）发生阳性杂交反应，敏感度为１ｐｇ．本实验制备的ＩＢＤＶｃＤＮＡ核酸探针不仅为ＩＢＤＶ的流行病学研究和分子生物学鉴定提供了敏感可靠的手段，而且也是核酸探针制备方法的一次探索。     

用地高辛标记的核酸探针从尿囊液和组织中检测传染性支气 …

将ＩＢＶＴ株基因组Ｓ１基因上０．６kb片段（位于Ｓ１基因上１１２１bp～１７２３bp之间）克隆到ＰＩＢ－ＰＣＲ Ｃloning vector中,用地高辛标记探针,分别与９株ＩＢＶ 的ＰＣＲ产物和１２株ＩＢＶ的核酸进行点杂交均呈阳性反应,而该探针不与ＩＢＤＶ和ＮＤＶ的ＲＮＡ,ＥＤＳ－７６病毒的ＤＮＡ及正常鸡胚尿囊液的抽提物反应。探针检测ＩＢＶ－ＰＣＲ产物的灵敏度为１００～２００pg。用该探针检测不同毒株ＩＢＶ在鸡胚中的繁     

应用复合引物扩增大肠杆菌肠毒素基因的研究

以两对合成的不同寡核苷酸引物通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）、扩增肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）不耐热肠毒素（ＬＴ）和耐热肠毒素（ＳＴ）基因；两对引物从ＥＴＥＣＬＴ和ＳＴ基因中分别扩增出３１４ｂｐ，２３７ｂｐ的ＤＮＡ片段，均能与相应的ＬＴ和ＳＴ基因探针杂交。ＬＴ扩增产物（３１４ｂｐ）和ＳＴ扩增产物（２３７ｂｐ）分别和ＳｍａⅠ和ＨｉｎｃⅡ酶切后，产生１９０ｂｐ和１２４ｂｐ，１４７ｂｐ和９０ｂｐ的ＤＮＡ片段。同一扩增反应中应用ＬＴ和ＳＴ复合引物进行扩增，３种基因型ＬＴ、ＳＴ和ＬＴＳＴＥＴＥＣ从样品中鉴定出。１０９份动物腹泻粪样分别用ＰＣＲ，核酸杂交和ＥＬＩＳＡ进行测定，结果表明，ＰＣＲ是最为灵敏和快速的测定ＥＴＥＣ的方法。     

限制性内切酶片段长度多态性有几个绵羊品种中的研究

本文利用羊的促卵泡激素（ＦＳＨ）ｃＤＮＡ，胸腺基因组ＤＮＡ及卵泡抑止素ｃＤＮＡ等３种探针与泰国长尾羊，咯麦隆羊及它们Ｆ１代杂种的基因组ＤＮＡ进行分子杂交，结果在ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ和ＴａｑⅠ酶切的ＤＮＡ片段与ＦＳＨ ｃＤＮＡ杂交的图谱上，可观察到ＲＦＬＰ的存在，并可根据某些特殊区带的存在与否区别两个不同种的羊。用ＥｃｏＲⅠ酶切的ＤＮＡ片段与胸腺基因组ＤＮＡ探针杂交，也发现了ＲＦＬＰ，而其它３种酶     

马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白D基因的分离克隆,定序及其在大肠杆…

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白（ｇＤ）抗原基因１２０９ｂｐ编码序列。将该ＰＣＲ扩增产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎⅠ位点克隆进行ｐＵＣ１８质粒载体中。将ｇＤ重组ｐＵＣ１８质粒ＤＮＡ用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｄｉｇ）标记后，在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ中，该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的Ｂａｍ ＨＩ－Ａ克隆中的Ａ     

新城疫病毒特异性糖蛋白基因探针的制备及应用

应用ＲＴ－ＰＣＲ获取新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的部分囊膜糖蛋白基因片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,长为９２６ｂｐ,与预期结果相符;将该基因片段定向克隆入质粒载体ＰＵＣ１９只,得到重组质粒Ｐ９２６,酶切分析结果与已发表的ＮＤＶ毒株酶切位点一致。     

禽传染性喉气管炎病毒TK基因狄高辛探针的研制及应用

应用狄高辛标记禽传染性喉气管炎病毒（ＡＩＬＴＶ）ＴＫ基因制备探针,经斑点杂交显色后,探针同以ＡＩＬＴＶ北京株为模板的ＴＫ基因ＰＣＲ产物及北京株核酸均呈阳性紫色斑点,而与正常尿囊液、新城疫病毒和火鸡疱疹病毒、禽传染性支气管炎病毒无反应,２株确诊为ＡＩＬＴＶ的野外分离毒也呈阳性。本研究结果表明,该ＴＫ基因探针是敏感和特异的,可用于禽传染性喉气管炎和其它呼吸道疾病的鉴别诊断。     

A novel oligonucleotide probe for the detection of Newcastle disease virus.

An approach that possesses high specificity and broad applicability was used to obtain a DNA probe with potential diagnostic value. By utilizing synthesized oligonucleotide DNA, termed NDV probe, all 14 strains of NDV tested under high-stringency conditions were recognized in a slot-blot hybridization assay. The sequence of the NDV probe was generated from a highly conserved region of the NDV genome. No hybridization was observed with RNA isolated from other avian viruses, including avian influenza, infectious bursal disease, and infectious bronchitis. The specificity inherent in using an oligonucleotide probe offers advantages over probes obtained from cloned DNA fragments.     

核酸探针检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

以地高辛(DIG)标记鸡传染性支气管炎病毒(IBV)pol基因的保守片段制成核酸探针,与IBV参考株、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽流感病毒、正常鸡胚尿囊液及正常鸡肾组织等的RT-PCR产物进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与IBV毒株的RT-PCR产物杂交呈阳性,与对照病毒和组织的RT-PCR产物杂交呈阴性.敏感性试验显示,探针最低能检出约3.4pg的IBV RT-PCR产物.用该方法检测了38份疑似IBV临床病料,31份阳性;而用RT-PCR法扩增IBV S2基因确诊为阳性的只有29份.对人工接种IBV H52弱毒苗鸡咽喉和肛门拭子32份进行检测,检出15份阳性.结果表明,利用DIG探针检测IBV的RT-PCR产物,特异性和敏感性强,可重复,能克服RT-PCR非特异性反应和探针Northern杂交的不稳定性.     

新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的克隆

以提纯的我国标准ＵＤＶＦ４８Ｅ８强毒株基因组ＲＮＡ为模板、化学合成的融合蛋白（Ｆ）基因特异寡核苷酸为引物，反转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ，并采用同聚物加尾的方法克隆到细菌质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（－）。经ＡＩＸ平板筛选和酶切分析，并用Ｆ基因片段核酸探针作ｄｏｔ－ｂｌｏｔ检测，共获得插入片段长度在０．６￣２．８ｋｂ之间的阳性克隆３４个，其中插入片段大于１．５ｋｂ的阳性克隆８个。用多种限制性内切酶对阳性克隆ｐＦ７     

禽偏肺病毒地高辛核酸探针的制备与应用

根据GenBank中已经发表的B亚型禽偏肺病毒F基因的保守序列设计并合成1对引物,利用RT—PCR扩增出1条与目的片段大小一致的725bp基因片段,回收、纯化PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记的aMPV核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与aMPV核酸发生特异性杂交,而与H9N2亚型AIV、NDV、IBV、ORT和E．coil的核酸杂交反应均为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对aMPV的最低检出量为5Pg。应用制备的探针对山东省不同地区的605份商品肉鸡和122份商品肉鸭进行了核酸探针检测,阳性检出率分别为36．59％和34．51％。本试验制备的aMPV地高辛探针特异性强、敏感性好,对样品的检测结果表明山东省部分地区的商品肉鸡、肉鸭中普遍存在aMPV感染。     

新城疫病毒F48E8株cDNA文库的构建

以新城疫病毒（ＮＤＶ）中国标准强毒株为材料，分别用基因组ＲＮＡ及ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ为模板反转录合成ｃＤＮＡ。将ｃＤＮＡ通过同聚物加尾ｐｏｌｙ（ｄＣ）后克隆于末端加有ｐｏｌｙ（ｄＧ）的线性化质粒ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）上，转化大肠杆菌ＴＧ１，经ＩＰＴＧ和Ｘ－ｇａｌ筛选及电泳检查，其中有５６个克隆含有大小在０．２～２．７ｋｂ范围的外源片段。斑点杂交鉴定有５２个是ＮＤＶｃＤＮＡ克隆，平均长度为１．３１ｋｂ，从而构建了ＮＤＶｃＤＮＡ文库。文库的统计学质量检验表明，拥有５２个克隆的Ｆ４８Ｅ８株ｃＤＮＡ文库可能覆盖ＮＤＶ整个基因组     

新城疫F_(48)E_9株L基因克隆与鉴定

本实验根据已知新城疫病毒L基因序列分别设计了两对引物 ,引物 1(L1)、引物 2 (L2 )、引物 3(L3)、引物 4(L4)。以L1/L2为引物可以扩出 40 5 0bpF4 8E9株L基因的A片段 (LA) ,以L3/L4为引物可扩增出 35 0 4bpF4 8E9株L基因的B片段 (LB)。LA和LB 2个片段经特异性双酶切后用T4DNA连接酶连接成完整的F4 8E9株L基因并克隆到pMD18_T载体中 ,对克隆后L基因 5’端、3’端和连接点处的核苷酸序列进行了测定 ,经DNASIS软件分析表明为NDVL基因 ,证明我们获得了F4 8E9株L基因     

表达新城疫病毒HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，用设计带有限制性酶切位点的特异地扩增子人起始密码子开始的１．８ｋｂ新城疫病毒（ＮＤＶ）血凝素－神经氨酸（ＨＮ）基因开放式阅读框（ＯＲＦ），然后插入ｐＴＫ２Ｂ的Ｎｂｅ１位点，构建了含ＮＤＶＨＮ基因的插入载体ＰＴＫＨＮ１和ＰＴＫＨＮ２，将其与感染火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）细胞的总ＤＮＡ共转民纤维细胞（ＣＥＦ），经有限稀释法和Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ筛选，得到含有ＨＮ基因的重组体ｒＨ