养殖大菱鲆感染迟缓爱德华氏菌的分离、毒力基因及ERIC-PCR分析

为了调查辽宁省葫芦岛市养殖患病大菱鲆Scophthalmus maximus病原菌感染情况,选用迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda特异性引物对分离菌株进行PCR鉴定,共分离得到22株迟缓爱德华氏菌。结果表明:迟缓爱德华氏菌毒力基因的PCR扩增显示,22株菌均含有kat B、fim A、gad B、esa V等基因;人工感染试验表明,22株迟缓爱德华氏菌感染并致大菱鲆累积死亡率均为100%;ERIC-PCR结果显示,迟缓爱德华氏菌模式菌株(ATCC15947)与分离株可分为2个基因型,分别标记为Ⅰ和Ⅱ型,其中22株迟缓爱德华氏菌分离株均为Ⅱ型,与ATCC15947菌株为Ⅰ型明显不同。本研究结果为养殖大菱鲆迟缓爱德华氏菌感染的防控提供了依据。     

养殖大菱鲆迟缓爱德华氏菌的分离鉴定与系统发育分析

从患病的大菱鲆成鱼体内分离到一株致病菌(编号1101),经人工感染试验证实该菌具有较强的毒力(LD50=3.34×106CFU/mL),并能从病鱼中重新分离出此菌.应用API20E自动鉴定卡及16S rRNA序列分析等方法对该菌进行了综合鉴定.结果显示菌株1101为革兰氏染色阴性、氧化酶阴性、触酶阳性,API20E鉴定系统鉴定为迟缓爱德华氏菌,相似率达99%.测定了其16S rRNA序列,长度为1419 bp,在GenBank上经同源性比对与迟缓爱德华氏菌聚为一类,同源性达99%,据此鉴定为迟缓爱德华氏菌(Ewardsiela tarda).药敏试验结果表明菌株1101对多粘菌素较敏感,而对其它药物中度或不敏感.     

养殖大菱鲆迟缓爱德华氏菌的分离鉴定与系统发育分析

从患病的大菱鲆成鱼体内分离到一株致病菌(编号1101),经人工感染试验证实该菌具有较强的毒力(LD50=3.34×106CFU/mL),并能从病鱼中重新分离出此菌.应用API20E自动鉴定卡及16S rRNA序列分析等方法对该菌进行了综合鉴定.结果显示菌株1101为革兰氏染色阴性、氧化酶阴性、触酶阳性,API20E鉴定系统鉴定为迟缓爱德华氏菌,相似率达99%.测定了其16S rRNA序列,长度为1419 bp,在GenBank上经同源性比对与迟缓爱德华氏菌聚为一类,同源性达99%,据此鉴定为迟缓爱德华氏菌(Ewardsiela tarda).药敏试验结果表明菌株1101对多粘菌素较敏感,而对其它药物中度或不敏感.     

养殖大菱鲆感染嗜水气单胞菌的分离、毒力分析及ERIC-PCR分型

为对辽宁省葫芦岛市养殖患病大菱鲆Scophthalmus maximus(L.)全年感染嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila情况进行调查,通过细菌16S rRNA基因序列分析,以及嗜水气单胞菌特异性引物和气溶素基因的双重PCR扩增对分离株进行鉴定。结果表明:调查中共分离到7株嗜水气单胞菌(AP40301、AP40401、AP40402、AP40403、AP40501、AP40502和AP40503),且均含有气溶素基因(aer A);ERIC-PCR结果进一步显示,7株嗜水气单胞菌存在独立基因型,分别标记为Ⅰ和Ⅱ型,其中Ⅰ型分离株中有3株来自绥中,1株来自兴城,Ⅱ型分离株3株均来自兴城;人工感染试验显示,7株嗜水气单胞菌均具有强致病性,致病率为100%。本研究结果可为养殖大菱鲆的临床诊断以及疾病防控提供理论依据。     

养殖大菱鲆感染嗜水气单胞菌的分离、毒力分析及ERIC-PCR分型

为对辽宁省葫芦岛市养殖患病大菱鲆Scophthalmus maximus(L.)全年感染嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila情况进行调查,通过细菌16S rRNA基因序列分析,以及嗜水气单胞菌特异性引物和气溶素基因的双重PCR扩增对分离株进行鉴定。结果表明:调查中共分离到7株嗜水气单胞菌(AP40301、AP40401、AP40402、AP40403、AP40501、AP40502和AP40503),且均含有气溶素基因(aer A);ERIC-PCR结果进一步显示,7株嗜水气单胞菌存在独立基因型,分别标记为Ⅰ和Ⅱ型,其中Ⅰ型分离株中有3株来自绥中,1株来自兴城,Ⅱ型分离株3株均来自兴城;人工感染试验显示,7株嗜水气单胞菌均具有强致病性,致病率为100%。本研究结果可为养殖大菱鲆的临床诊断以及疾病防控提供理论依据。     

大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力和耐药基因检测分析

为探究2019年山东省烟台市某大菱鲆Scophthalmus maximus养殖场出现的以腹水、体表及内脏出血为主要症状的疾病发病原因,通过平板划线法从患病濒死大菱鲆(体质量为350 g±5 g)肝、肾、脾和心等组织中分离获得1株优势菌,采用形态学观察,16S rRNA、gyrB基因和rpoB基因序列分析,PCR特异性引物扩增,以及人工回归感染试验等方法对优势菌进行鉴定,检测其毒力基因、耐药基因携带情况,并采用纸片扩增法(K-B)检测分离株对10类23种抗生素的敏感性。结果表明：从患病鱼分离获得的菌株,生理生化特征为革兰氏阴性杆菌,赖氨酸、鸟氨酸和葡萄糖产酸等试验呈阳性,枸橼酸、精氨酸、蔗糖、甘露醇、苦杏仁苷、尿素、硝酸盐还原和氧化酶等试验呈阴性;经16S rRNA、gyrB基因、rpoB基因序列比对,以及爱德华氏菌特异性引物扩增等鉴定,确定其为杀鱼爱德华氏菌Edwardsiella piscicida;该菌的毒力基因型为fimA⁺-fimB⁺-fimC⁺-fimD⁺-esrB⁺     

鸡抗迟缓爱德华氏菌卵黄抗体的应用研究

从全身出血合并腹水的养殖大菱鲆Scophthalmus maximus体内分离出1株细菌,经感染试验证实其病原性,并鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda。采用该菌制成全菌油乳性灭活疫苗,分4次给蛋鸡进行免疫注射,第2次加强免疫后开始收集鸡蛋,制备卵黄抗体(IgY)和其水溶性组分(W SF),并用试管凝集法测定其效价。取效价达到1∶64的鸡蛋提取卵黄抗体,分别采用口服和腹腔注射两种方式给大菱鲆进行免疫:配成含W SF 1 mL/g的饵料,给鱼连续投喂15 d;用含蛋白含量0.19 mg/mL的纯化IgY,于第1、3、14 d对大菱鲆进行腹腔注射,剂量为0.1 mL尾/。免疫后分别用注射和划伤浸泡两种方法攻毒。结果表明,口服特异性卵黄抗体对大菱鲆的免疫保护率分别为83.3%和100%,而注射免疫没有保护作用。     

迟缓爱德华氏菌的粘附特性

用绵羊红细胞对不同来源的１５株迟缓爱德华氏菌作血凝试验。结果表明，１５株ＥＴ均具有血凝性，且不能为甘露糖，蔗糖，葡萄糖所抑制。分别用甲醛，戊二醛，胰蛋白酶处理ＥＴ的模式菌株ＥＴ９９菌体，能抑制细菌血凝。提纯的ＥＴ９９菌株的鞭毛蛋白，外膜蛋白均无血凝性。同时用ＨＥｐ－２细胞分析了１５株ＥＴ的细胞粘附特性。结果表明，有１０株ＥＴ能粘附ＨＥｐ－２细胞、粘附菌数大于１０ＣＦＵ／细胞。分别用甲醛，戊二醛，胰     

丝氨酸蛋白酶Pic在迟缓爱德华氏菌侵染鱼类中的作用

本研究用染色体步移的方法从一株鱼类致病性迟缓爱德华氏菌TX01中克隆了丝氨酸蛋白酶的一个重要成员Pic基因,并利用缺失突变的方法构建了其基因突变株TXPic。通过比较突变株与野生株侵染大菱鲆及其外周血白细胞和头肾单核细胞的差异,发现TXPic的侵染能力较TX01有明显降低,这表明Pic可能作为毒力因子在迟缓爱德华氏菌侵染过程中发挥重要作用。     

龟源迟缓爱德华氏菌分离鉴定及灭活疫苗研制

【目的】利用从发病死亡的中华草龟(Chinemys reevesii)分离到的病原菌株制备灭活疫苗。【方法】对该菌进行培养特性、生理生化特征、16S rRNA同源性分析、药敏等试验。人工感染中华花龟(Ocadia sinensis),确定半数致死剂量(LD50)。经0.03%甲醛灭活后与铝胶3∶1制成灭活疫苗,对中华花龟进行腹腔注射免疫,测定血清抗体效价,以5LD50活菌浓度进行攻毒试验测定免疫保护率。【结果】分离鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌。两次免疫14 d后抗体效价分别为1∶64和1∶256,在5LD50剂量攻毒后相对免疫保护率分别为60%和73%。【结论】本灭活疫苗二免的相对保护率达73%,有保护效果,可用于龟的迟缓爱德华氏菌病的预防。     

近交对大菱鲆体尺性状生长的遗传影响

为研究近交对大菱鲆体尺生长的动态影响,构建了非近交和2个不同近交水平的30个家系。在生长期内,定期测量了1 082尾个体的全长、体长、头长、体宽和尾柄高等体尺性状。选择三阶勒让德(Legendre)多项式为子模型,采用随机回归模型估计了这些体尺性状的遗传参数。考虑近交和不考虑近交作为固定效应的随机回归分析表明:近交显著地提高了所有体尺性状遗传力估计值。与远交组相比,近交导致了体尺性状不同程度的衰退,但衰退程度在2个近交组间没有表现出明显差异。5个体尺性状之中,全长和体长表现出较为相似的近交衰退趋势,而体宽、头长和尾柄高表现出较为一致的趋势。与非近交组相比,全长和体长在350日龄前,近交系数0.25的个体体长性状并未出现近交衰退,反而有所提高,而近交系数为0.375的组,这2个性状表现出衰退。全长和体长的近交衰退随着年龄的增长而加重。0.25和0.375两种近交水平的群体在第400和第650生长日之间对体长的生长曲线几乎没有影响。在整个测量周期内,近交水平对尾柄高的生长曲线的影响几乎没有差异。而在第650生长日龄后,全长、体长和头长的近交衰退随着近交程度增加而加快。这些近交分析的结果可以用来指导大菱鲆配套系选育过程中亲本群体遗传纯化过程中的近交控制。     

大菱鲆源副乳房链球菌的分离鉴定及其毒力基因型

为研究2019年山东省烟台市某大菱鲆Scophthalmus maximus养殖场出现的以突眼、腹水、红肿为主要特征的疾病发病原因,用平板划线法从患病濒死大菱鲆(体质量为195～535 g)肝、肾、脾、心等组织中分离获得1株优势菌,采用形态学观察、16S rRNA序列分析、PCR特异性扩增和人工回归感染试验等方法对优势菌进行鉴定,检测其血清型、毒力基因携带情况,并用纸片扩散法(K-B)检测分离株对23种抗生素的敏感性。结果表明:从病鱼分离获得的菌株为γ溶血的革兰氏阳性球菌,生理生化特征为能水解七叶苷,不能水解精氨酸、赖氨酸等,能利用蔗糖、甘露醇、葡萄糖产酸,不能利用枸橼酸、鼠李糖、尿素等;经16S rRNA序列比对、链球菌特异性引物扩增等鉴定其为副乳房链球菌Streptococcus parauberis;该菌株的毒力基因型为scp B^--bca--bca^--bac--bac^--lmb--lmb^--fbs A--fbs A^--cfb--cfb^--cps D--cps D^--pav A--pav A^--bib A--bib A⁺-sip+-sip⁺-cyl E+-cyl E^--hyl B--hyl B⁺;将分离菌株制备成6.3×10+;将分离菌株制备成6.3×10⁷、6.3×107、6.3×10⁸、6.3×108、6.3×10⁹、6.3×109、6.3×10⁽¹⁰⁾ CFU/mL 4个浓度,腹腔注射健康大菱鲆,得到菌株对受试鱼的半致死浓度(LD_(50))为6.9×10(10) CFU/mL 4个浓度,腹腔注射健康大菱鲆,得到菌株对受试鱼的半致死浓度(LD_(50))为6.9×10⁸ CFU/mL;药敏试验显示,该菌株对β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、多肽类、利福霉素类等6类14种抗生素类药物敏感,对氨基糖苷类、磺胺类及呋喃类等3类6种抗生素耐药,对诺氟沙星、强力霉素、多粘菌素B中度敏感。本研究中首次报道了中国鱼源副乳房链球菌自然感染发病,可为鱼源副乳房链球菌分子特性研究、致病机理、药物防治等提供科学参考。     

大菱鲆源副乳房链球菌的分离鉴定及其毒力基因型

为研究2019年山东省烟台市某大菱鲆Scophthalmus maximus养殖场出现的以突眼、腹水、红肿为主要特征的疾病发病原因,用平板划线法从患病濒死大菱鲆(体质量为195～535 g)肝、肾、脾、心等组织中分离获得1株优势菌,采用形态学观察、16S rRNA序列分析、PCR特异性扩增和人工回归感染试验等方法对优势...     

漠斑牙鲆迟缓爱德华氏菌的分离与鉴定

[目的]为有效防治漠斑牙鲆疾病提供基础资料。[方法]通过病原菌的分离培养、人工感染试验、生理生化鉴定研究了导致漠斑牙鲆患病的病原。[结果]镜检结果表明：该病原菌为革兰氏阴性杆菌,菌体无荚膜,无芽孢,大小多为（0．5～0．9）μm×（1．1～2．0）μm。在普通营养琼脂平板上形成浅灰色、直径约0．5—1．0mm的菌落;在血液琼脂平板上形成浅乳白色菌落,其中可见狭窄的B溶血环;在SS琼脂平板上形成中间黑色、周边透明的圆形小菌落。腹腔注射菌悬液的漠斑牙鲆在7d内全部死亡。从发病漠斑牙鲆的肝、肾和脾等组织中可分离出与原病原菌一致的菌株,经再次感染又可分离到该菌株。[结论]所分离的3株病原菌为迟缓爱德华氏菌,具有原发病病原学意义及强致病作用。     

迟钝爱德华氏菌黏附及侵袭特性的研究

将引发养殖大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症的病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda(L-49231)接种于体外培养细胞——人上皮角质层形成细胞(HaCaT-cell),观察其对细胞的黏附性和侵袭性,研究了不同作用时间下以及用不同因素处理菌体后,细菌对HaCaT细胞黏附性及侵袭性的影响。结果表明:L-49231菌株能黏附HaCaT细胞,2 h后即可侵入细胞;随着作用时间的延长,细菌黏附细胞与侵入细胞的数量增加。分别用甲醛、戊二醛、盐酸、胰蛋白酶处理L-49231菌体,细菌的黏附力及侵袭力均有所下降;用蔗糖、甘露糖处理L-49231菌体时,细菌的黏附力变化不大;用葡萄糖处理时,能够促进细菌对细胞的黏附作用。用甘露糖和葡萄糖处理菌体时,能促进细菌对细胞的侵袭;用蔗糖处理菌体时,能部分抑制细菌对细胞的侵袭作用。用抗体处理L-49231菌体后,细菌的黏附力及侵袭力均明显下降。说明L-49231菌株对HaCaT细胞具明显的侵袭性,其主要黏附因子为胞外蛋白质成分,无确切的糖受体。