Oct4,Sox2,Nanog和c-Myc基因在蚯蚓发育早期的表达

通过已知物种的干细胞多能性基因核酸序列,利用同源序列法,成功克隆得到赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)的Oct4,Nanog,Sox2和c-Myc 4个基因,并通过实时荧光定量PCR分析了上述4个基因在赤子爱胜蚓茧孵化期间的表达情况。结果表明:赤子爱胜蚓茧在孵化期0~21 d,4个基因呈相似的规律,表达量均逐步升高,在21 d达到峰值;在幼虫期Oct4,Nanog和c-Myc 3个基因的表达量高于孵化期。结果表明,上述基因在赤子爱胜蚓早期发育过程中表达模式具有一定的相似性。     

小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达

【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。     

水牛朊蛋白成熟片段基因的克隆与原核表达

【目的】克隆、分析水牛朊蛋白（prion protein，PrP）成熟片段基因，并获取纯化的表达产物。【方法】将应用PCR技术扩增的水牛成熟PrP的核酸序列克隆到表达载体pET-32a，并分析其序列；把阳性克隆质粒pET-32a-BPrP转化表达菌BL21(DE3)，鉴定纯化的表达产物。【结果】水牛朊蛋白成熟片段核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其他牛科动物的成熟PrP核酸、氨基酸序列间的相似性分别在97.1%和97.2%以上，并且发现水牛成熟PrP有5个重复序列，编码的氨基酸序列其中有2个九肽和3个八肽重复序列。具有较高的表达水平的PrP融合蛋白被纯化后，用Western印迹实验证明该蛋白具有PrP抗原活性。【结论】首次报道了克隆、分析水牛朊蛋白成熟片段基因，发现水牛成熟PrP有5个重复序列，并获得了具PrP抗原活性的水牛成熟PrP融合蛋白。     

毛白杨4CL-like基因的克隆与原核表达分析

为得到毛白杨4CL-like基因并对其原核表达特性进行分析,利用毛白杨叶片的总RNA反转录得到的总cDNA为模板,利用PCR技术克隆得到毛白杨4CL-like基因(登录号:XP_002315339.1).利用MEGA软件对4CL-like基因及其他9个来自不同物种的4CL基因进行进化树分析.最后通过构建pET30-4CL-like原核表达载体对该基因进行原核表达分析.结果显示,克隆得到的4CL-like基因CDS区全长为1 758 bp,编码585个氨基酸.系统进化分析表明,该基因与葡萄中的4CL-like5有很高的同源性.另外,SDS-PAGE分析表明,4CL-like基因在大肠杆菌BL21中成功表达,所表达融合蛋白的分子量约为60 ku.     

绵羊Oct4基因启动子序列的克隆及其与猪和牛序列的比较分析

为探明绵羊Oct4基因启动子的结构特点,用PCR方法克隆获得了绵羊Oct4基因启动子,并对绵羊、牛和猪Oct4基因的上游调控序列进行对比分析。结果显示,成功扩增获得长度为2 951 bp的绵羊Oct4基因启动子;绵羊、牛和猪Oct4基因的上游调控序列均含有4个保守区域(CR1–CR4),且4个保守区域在3个物种间具有高度同源性;CR1区域富含GC碱基对,且序列上的Sp1/Sp3位点与激素反应元件HRE在3个物种中具有100%的同源性;绵羊和牛、猪的上游调控序列富含GC,并存在大量的CCC(A/T)CCC位点。     

鳜鱼生肌调节因子基因(mrf4)的克隆及其在成鱼和胚胎中的表达

为分析鳜鱼(Siniperca chuatsi)生肌调节因子基因(mrf4)的特征,阐明其在鳜鱼不同组织以及胚胎发育不同时期的表达规律,用反转录PCR法扩增鳜鱼mrf4 的cDNA序列,并将其连入克隆载体,进行测序、分析;用荧光定量PCR检测mrf4基因在不同组织及胚胎发育不同阶段的表达情况。结果：克隆的鳜鱼mrf4 cDNA全长为726 bp,编码的蛋白质含241个氨基酸,具有生肌调节因子的典型的碱性螺旋–环–螺旋结构;mrf4在成体鳜鱼白肌、红肌、心脏、脑以及不同发育阶段的胚胎中均有表达,在红肌中的表达量显著高于在其他组织中的表达量(P<0.05);在胚胎发育阶段的原肠期、尾芽期、肌肉效应期,mrf4的表达量呈递增趋势,而在胚胎发育的心搏期、血液循环期、仔鱼期,mrf4的表达量呈递减趋势,肌肉效应期mrf4的表达量明显高于胚胎发育的其他阶段的mrf4表达量(P<0.05)。     

绵羊Nanog基因部分编码序列的克隆及分析

利用NCBI中GenBank里查询到已登录的人、猪、牛和山羊的NanogmRNA序列,通过多重同源比较,获得高度保守区域序列,设计了同源引物,并首次对绵羊Nanog部分编码序列进行了分子克隆。经过PCR扩增,获得绵羊Nanog基因第二外显子168 bp(GenBank Accession:EF436277)、第四外显子124 bp(GenBank Acces-sion:EF596905)和第二外显子至第四外显子498 bp(GenBank Accession:EU016097)三个序列片段。经测序,三个序列已登录GenBank。绵羊Nanog第二显子168 bp与山羊相应序列相似性最高达97%,与人相应序列相似性最低达84%;绵羊Nanog第四显子124 bp与山羊相应序列相似性最高达100%,与人相应氨基酸序列相似性最低达73%;经判断,绵羊Nanog第二外显子至第四外显子498 bp序列片段应该是一段假基因序列,与山羊mRNA相应序列相似性最高达98%,与人mRNA相应序列相似性最低达83%。本研究为进一步研究绵羊Nanog基因表达谱提供了序列信息。     

胡萝卜1个新4CL基因的克隆、进化及表达分析

胡萝卜(Daucus carota L.)在NCBI(美国国家生物信息中心)上总共公布了13个4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)基因,而在芹菜转录数据中发现1个4CL基因,利用该基因序列设计1对克隆引物,成功得到1个新胡萝卜4CL基因,命名为Dc4CL-1。Dc4CL-1基因长1 635 bp,编码544个氨基酸,位于胡萝卜基因组第2染色体上。进化树分析显示,Dc4CL-1基因聚集在与木质素合成有关的4CLⅠ亚族。实时荧光定量PCR转录表达发现,在胡萝卜根生长发育期间,Dc4CL-1基因在野生胡萝卜中高表达,而在栽培胡萝卜中低表达。推测Dc4CL-1基因与胡萝卜木质素合成有关。     

鸡Ii基因的克隆、鉴定及其原核表达

从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中提取总RNA,用自行设计的一对引物通过RT—PCR方法扩增出鸡恒定链(invariant chain,Ii)基因片段。经酶切鉴定后,再将该片段克隆到pcDNA3载体中,测定其DNA序列,结果表明该片段长度为669bp,其DNA序列与GenBank登录的基本一致。再将该片段插入原核表达载体PGEX-4T-1,并导入菌株BL21,经诱导培养、蛋白提取和SDS—PAGE,获得分子量约为50kD的特定蛋白条带,表明所克隆的鸡Ii基因在原核细胞中得到表达。     

蚯蚓MT基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了研究蚯蚓金属硫蛋白的生物学功能,采用RT-PCR方法从镉诱导后的赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)中克隆到蚯蚓金属硫蛋白基因cDNA。将其克隆入原核表达载体pET-DsbA中,然后转化至大肠杆菌表达受体菌BL21(DE3)中进行表达。产物经SDS-PAGE进行分析,可见约32.4 kD的融合蛋白。Zn2+抗性测定表明含pET-DsbA-efMT的重组菌较含空载体pET-DsbA的对照菌重金属抗性有所提高。     

小鼠Oct4基因的克隆及其原核表达载体的构建

Oct4是POU区转录因子家族中的一员,在未分化胚胎癌和胚胎干细胞中表达.对细胞未分化状态的维持发挥重要作用。本文通过RT-PCR方法克隆得到小鼠Oct4基因,并成功构建其原核表达载体pET-15b-Oct4,为今后对其功能及生物学活性的进一步研究奠定了基础。     

水牛NAAA基因克隆分析及其真核表达载体构建

为了阐明水牛N-酰基乙醇胺酸酰胺酶（N-acylethanolamine acid amidase,NAAA）基因在水牛卵泡发生和胚胎发生过程中的作用及分子机制,本试验采用了3'Race、生物信息学分析、载体构建和细胞转染等技术对NAAA进行了研究。结果表明：水牛NAAA基因的编码区全长1 071 bp,共编码356个氨基酸;多重序列比较分析显示：水牛NAAA核苷酸序列与牛、山羊、绵羊、猪、马、猫和人相应序列的相似性分别为98%、96%、95%、87%、87%、85%和84%,结合系统进化树分析结果,NAAA基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。对NAAA蛋白质的分析表明：该蛋白呈弱酸性,第26~27位氨基酸为其信号肽,细胞亚定位于溶酶体,存在NAAA-beta和Ntn_AC_NAAA结构域。成功构建水牛NAAA基因真核表达载体,转染293 T后,能够正确形成NAAA-EGFP融合蛋白,产生绿色荧光信号。研究结果为阐明NAAA基因在水牛卵泡发生和胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了理论基础。     

猪CatSperB和CatSperG基因的克隆、表达及生物信息学

【目的】揭示猪CatSperB和CatSperG基因的存在、蛋白的结构特征、进化关系及时空表达特性。【方法】利用电子和分子克隆技术鉴定猪CatSperB和CatSperG基因全长cDNA,并利用定性RT-PCR和荧光定量RT-PCR进行CatSperB和CatSperG基因的时空表达研究。【结果】①分别获得了3 508 bp CatSperB和3 715 bp CatSperG电子转录子,分别包含3 330和3 483 bp开放阅读框,并经TA克隆测序验证,其CDS序列与人、牛、马和狗等的CatSperB和CatSperG基因的序列相似性在80%以上;②CatSperB分子质量为125.79 kD,为稳定蛋白;CatSperG分子质量为133.40 kD,为不稳定蛋白;③CatSperB和CatSperG 都包含 7 个通道蛋白保守的跨膜结构域,CatSperG蛋白C端含一个超螺旋结构,而CatSperB蛋白无明显的超螺旋结构信号;猪CatSperB和CatSperG与牛、狗和马的CatSperB和CatSperG蛋白同源关系较近,与人和小鼠的同源关系较远;④RT-PCR分析表明,CatSperB和CatSperG基因主要在睾丸中表达,但CatSperB在其它组织也有表达信号;⑤CatSperB和CatSperG基因mRNA表达水平在猪性发育的重要阶段,精子发生（60日龄）、初情期（90日龄）和性成熟（150日龄）前后都有显著提高（P＜0.05）。【结论】获得了猪CatSperB和CatSperG基因的cDNA克隆及其一系列生物信息学参数,揭示了CatSperB和CatSperG蛋白含7个保守的跨膜结构域及不同物种间的进化关系,证实CatSperB和CatSperG基因主要在睾丸表达,且其mRNA表达变化与公猪的性发育相一致。     

磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达

[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27;的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础.     

甘蔗苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗的苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）,分析其序列特征及其在不同组织和5种胁迫条件下的表达情况,为此基因在甘蔗抗逆育种中的应用提供理论支撑。【方法】利用串联飞行时间质谱仪对差异表达蛋白质进行质谱鉴定分析,通过RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号（ROC22）中克隆PAL,以生物信息学方法对其序列进行预测分析,利用real-time PCR分析PAL在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗PAL,命名为ScPAL,GenBank登录号为KC172559。该cDNA全长2 590 bp,含有1个2 115 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码704个氨基酸。序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,与其它植物的PAL蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScPAL与高粱的PAL蛋白亲缘关系较近。real-time PCR分析表明PAL为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的66倍。其在低温（4℃）、聚乙二醇（PEG）、NaCl和H2O2四种外源胁迫下均诱导表达,但表达模式不同。【结论】从甘蔗品种ROC22中克隆获得苯丙氨酸解氨酶基因（ScPAL）,是典型的PAL家族成员,推测其参与了甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱和抗盐胁迫过程也起到某种作用。     

牛A组轮状病毒VP4全基因的克隆与原核表达

以G6型牛轮状病毒总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增牛轮状病毒VP4开放性阅读框,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pEASy-T3载体中,成功构建出克隆质粒pEASY-T3-VP4.经双酶切后再将该基因重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建出原核表达质粒pET32a-VP4.将pET32a-VP4转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约108 KD的融合蛋白带,成功构建了能够稳定表达VP4蛋白的基因工程菌株,为进一步研制牛轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

平邑甜茶金属硫蛋白基因MhMT2的克隆和表达分析

【目的】克隆平邑甜茶金属硫蛋白（metallothionein,MT）基因,探讨该基因对逆境的响应机理,为苹果抗逆分子育种提供依据。【方法】采用电子克隆和RT-PCR技术从平邑甜茶叶片中克隆MhMT2基因,利用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推测氨基酸序列进行分析,通过定量PCR技术研究在胁迫条件和激素处理下该基因在叶片中的表达模式。【结果】平邑甜茶MhMT2基因cDNA全长534 bp,具有1个243 bp的完整开放阅读框,编码含80个氨基酸的多肽,其分子量为7.87 kD。同源性比对显示,MhMT2编码的氨基酸序列与其它植物的MT2蛋白有很高的相似性,其中与小金海棠的同源性最高,达到96.4%。MhMT2编码的多肽包含14个Cys残基,其N端富含Cys的结构域具有C-C、C-X-C和C-X-X-C基序,而C端仅有C-X-C基序。聚类分析显示,该基因属于植物MT2基因家族。定量PCR分析表明,MhMT2基因在叶中表达量最高,其次是根,在茎中表达量最低。在ABA、H2O2、机械损伤及NaCl处理下,该基因在叶片中的表达都上调,其中以H2O2最明显。【结论】对MhMT2基因在ABA、H2O2、机械损伤及盐胁迫下的表达模式分析,预示该基因表达水平在植物抗逆反应中起着重要作用。