高效银耳芽孢遗传转化体系的建立

【目的】建立PEG介导的高效银耳（Tremella fuciformis）芽孢遗传转化体系。【方法】采用PEG介导的原生质体法把表达质粒pAN7-1（含有构巢曲霉gpd-An 启动子和潮霉素抗性基因hph）和pLg-hph（含香菇gpd-Le启动子和hph基因）转化进银耳芽孢的细胞中;采用夹层法在含50 µg•ml-1潮霉素的筛选培养基中初筛银耳芽孢假定转化子,之后转接于潮霉素含量为100 µg•ml-1的PDA平板上进行第2次筛选。【结果】PEG4000浓度为25%时介导的银耳芽孢原生质体初转化率最高;pLg-hph假定转化子经过PCR鉴定及Southern 杂交验证,结果表明hph基因能有效整合进银耳芽孢的基因组中,其转化率为110个/µg DNA。而pAN7-1转化子经过PCR鉴定及Southern 杂交验证,结果表明只有部分转化子基因组中整合了hph基因,其转化率只有9个/µg DNA。银耳芽孢转化子在PDSA培养基中继代5次后仍检测到hph基因的存在,表明外源基因hph能在银耳芽孢继代中稳定遗传。【结论】25%的PEG4000能高效介导银耳原生质体的转化;香菇gpd-Le启动子是银耳芽孢表达外源hph基因的强启动子;外源hph基因能够在银耳芽孢继代培养中稳定遗传。     

玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因 StPKS 功能分析

 【目的】利用RNA干扰技术初步探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因（StPKS）的功能。【方法】本试验将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSilent-1载体中,构建StPKS基因的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2。通过聚乙二醇介导的方法转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体,利用潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子StPKS基因的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异。【结果】本研究构建的StPKS基因RNA干扰载体对沉默该基因表达是有效的,经潮霉素抗性筛选,得到了30株阳性转化子,对其中5株黑色素积累下降、菌落颜色变浅的转化子进行了半定量PCR分析发现,5株转化子的StPKS基因表达量均有所下降;显微观察发现5株转化子的菌丝形态很不规则,发生了膨大、变形、分枝等现象。【结论】StPKS基因在DHN黑色素合成途径中起作用,其表达量下降会减少黑色素的产生,试验同时发现该基因与菌丝形态密切相关。     

PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola原生质体转化

为建立PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola的遗传转化体系,以果生刺盘孢SQ06-E的幼嫩菌丝为受体,通过PEG介导的原生质体转化法,将含有潮霉素标记的质粒pCB1003转入果生刺盘孢菌丝的原生质体中;对获得的转化子进行遗传稳定性检测、PCR检测和Southern杂交分析。试验获得果生刺盘孢的最优转化体系为:密度为1×106 mL-1分生孢子在M3S培养基中,28℃、200r/min震荡培养8h;过滤收集菌丝,在质量浓度为0.25g/mL崩溃酶+0.05g/mL溶壁酶的10mL酶解液中加入0.5g湿菌体酶解3h;整个试验的渗透压稳定剂为0.8mol/L KCl。试验共得到76个转化子,转化率为1μg DNA获得3~4个转化子。对转化子的PCR检测和Southern杂交分析都表明hph基因已整合入果生刺盘孢的基因组中。所有转化子在PDA培养基上继代5次后仍能正常生长,说明外源基因hph能在果生刺盘孢中稳定遗传。     

玉米大斑病菌REMI体系的建立及突变体分析

 【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到 1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50 μg?mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌发和菌落生长完全受到抑制,可选用该浓度作为转化子的筛选浓度;使用pAN7-1转化效率较高,对利用该体系转化获得的大量转化子进行PCR检测中筛选出了部分产孢量和致病力变化的突变菌株。【结论】建立了玉米大斑病菌的REMI遗传转化体系,将为玉米大斑病菌突变体库的建立和致病相关基因的克隆奠定基础。     

链格孢菌苹果致病型的ATMT转化体系的建立

【目的】链格孢菌（Alternaria alternate）苹果致病型是苹果上的重要致病菌,可以侵染苹果叶片和果实。论文旨在建立农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型高效稳定的分子转化体系,为在分子水平上研究链格孢苹果致病型病菌的致病机制提供技术支持。【方法】质粒pKO1-HPH是以pCAMBIA1300骨架为基础构建的穿梭质粒,含有潮霉素抗性基因,并在其多克隆位点上插入了绿色荧光蛋白基因,这个质粒在大肠杆菌和农杆菌细胞中都能够稳定地复制繁殖。将质粒pKO1-HPH采用冻融法转化到农杆菌菌株AGL1中,然后与链格孢苹果致病型菌株XP-1的分生孢子在诱导培养基上共培养进行基因转化,转化子在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选;在含有50 μg·mL^-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上检测转化子细胞中抗性基因在转化子中的表达情况;用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白基因在转化子细胞中的表达情况。在初步确认可以将绿色荧光蛋白和潮霉素B磷酸转移酶基因转入链格孢苹果致病型菌株中后,对菌落培养时间、转化前分生孢子的预处理方法对转化效率的影响进一步优化。转化子的稳定性采用分生孢子5次继代培养后,能否在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上稳定生长来检测;采用PCR方法检测绿色荧光蛋白外源基因和潮霉素B磷酸转移酶基因是否存在于转化子基因组中;用Southern杂交检测外源基因在转化子基因组中插入的拷贝数;在苹果果实和叶片上接种检测转化子致病性的变化。【结果】将100 μL孢子悬浮液（含10⁵孢子）涂布于马铃薯-胡萝卜-琼脂平板上菌落培养36-48 h后,链格孢苹果致病型菌株XP-1可以产生足量的孢子用于农杆菌介导的分子转化。将分生孢子用无菌水洗下,在4℃处理6 h,再与含质粒pKO1-HPH的农杆菌进行诱导共培养,转化子在含有50 μg·mL^-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选,转化效率较好,10⁷个分生孢子转化可获得约200个转化子。转化子经过5次继代培养,对潮霉素B的抗性没有改变。特异性引物PCR检测表明外源基因能够成功地整合到供试菌株的基因组中;Southern杂交表明外源基因多以单拷贝形式随机插入到链格孢苹果致病型菌株XP-1细胞的基因组中;转化子的菌丝和分生孢子在荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光,说明荧光蛋白基因在菌丝及孢子中均能够成功表达。通过部分转化子的致病性试验,筛选获得数个在苹果果实和叶片上致病性都显著降低的菌株。【结论】建立了农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型稳定高效的分子转化体系,为进一步开展此病菌与其寄主的分子互作研究打下基础。     

以潮霉素B抗性基因为选择标记的水稻立枯丝核菌遗传转化体系的构建

使用含裂解酶(来自Trichoderma harzianum)10mg/ml的0.8MNaCl(Ph5.8),28℃下,处理水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝8小时,获得其原生质体。采用PEG介导的方法,将含有潮霉素B抗性标记的质粒pSM565转入水稻立枯丝核菌的原生质体,并在潮霉素B浓度为30μg/ml的选择性培养基上筛选转化子,获得了5-6个转化子/μgDNA的转化频率。随机挑选8个转化子,通过PCR方法检测到其中存在潮霉素抗性基因。     

黑曲霉分泌表达载体的构建以及绿色荧光蛋白的表达

采用PCR扩增得到糖化酶基因启动子（PglaA-g）、色氨酸合成酶基因终止子（TtrpC）和潮霉素抗性筛选标记基因,依次连接这些基因元件,获得黑曲 Aspergillus niger 分泌表达载体pPHT. EGFP 基因与黑曲霉表达载体pPHT连接,得到重组表达载体pPHT-EGFP.pPHT-EGFP表达载体通过原生质体转化法转化黑曲霉,经潮霉素抗性筛选、基因组PCR鉴定阳性重组转化子.荧光显微镜观察表明,绿色荧光蛋白成功表达,而且荧光的分布具有一定的规律,主要集中在菌丝顶端、膈膜以及培养基中;固体培养基发出绿色荧光,表明绿色荧光蛋白分泌到培养基中,属于分泌性表达,蛋白分泌的部位主要位于菌丝顶端.     

以潮霉素抗性为选择标记的毛壳霉原生质体转化

利用PEG方法，将含有潮霉素抗性标记的质粒pCB1003转化毛壳霉原生质体,并在高于毛壳霉敏感的潮霉素浓度下筛选转化子。转化率达1～2个转化子/μg质粒DNA。以潮霉素抗性的毛壳霉转化子的基因组DNA为模板进行PCR扩增及其产物的Southern杂交。结果表明，潮霉素抗性基因已整合入毛壳霉染色体。稳定性试验表明，所获得的转化子可通过有丝分裂稳定传代。     

拟南芥MPK3、MPK4、MPK6在酵母hog1?中的渗透调节作用

【目的】研究拟南芥MAPK信号转导途径的关键基因MPK3、MPK4、MPK6的功能,明确其在渗透调节中的作用。【方法】构建拟南芥MPK3、MPK4、MPK6的酿酒酵母表达载体,遗传转化酿酒酵母渗透调节功能丧失的hog1?突变体,筛选得到阳性转化子,并分析其在渗透胁迫下的表型特征。【结果】扩增得到了拟南芥MPK3、MPK4、MPK6的全长cDNA序列,构建了上述3个基因的表达载体,并筛选得到了3个基因的阳性转化子。在1 mol•L-1 KCl、0.3 mol•L-1 LiCl、1 mol•L-1 NaCl、1 mol•L-1 Sorbitol的盐胁迫处理下,阳性转化子生长状态良好,与野生型的表型基本一致,均恢复了hog1?对盐胁迫的抗性。在盐胁迫处理下,hog1?细胞形态异常且体内甘油含量较野生型低,而转化子的形态和体内甘油含量均恢复到正常的表型。【结论】MPK3、MPK4、MPK6均能够使酿酒酵母渗透调节功能丧失突变体hog1?恢复对盐胁迫的抗性,具有渗透调节的功能。     

斜卧青霉转录调控蛋白Hac1过表达菌株的构建

【目的】以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,构建斜卧青霉转录调控蛋白Hac1激活形式基因(Hac1i)随机插入过表达菌株和非激活形式基因(Hac1u)原位插入过表达菌株,并初步观察Hac1基因的2种不同编码蛋白在菌丝内部的运动情况,为进一步研究转录调控蛋白Hac1的功能奠定基础。【方法】分别克隆ptrA筛选标记、gpdA启动子、Hac1i编码区、eGFP编码区及终止子,利用融合PCR融合克隆片段,构建Hac1i随机插入表达盒;再分别克隆Hac1上游臂及编码区、eGFP编码区及终止子、ptrA筛选标记、Hac1下游臂序列,融合克隆片段,构建Hac1u原位插入表达盒。将2种表达盒分别转化斜卧青霉原生质体,通过吡啶硫胺素筛选标记、PCR扩增等检测获得阳性转化子,荧光显微镜观察融合蛋白的表达及运动情况。【结果】成功构建了Hac1i基因随机插入表达盒和Hac1u基因原位插入表达盒,利用原生质体转化将2种表达盒转入宿主斜卧青霉菌株,经PCR初步验证,得到了阳性转化子。阳性转化子在麸皮培养基上培养2~4d后,可在菌丝内部清晰观察到强烈的绿色荧光信号,表明融合蛋白在菌丝体内得到了正确表达。【结论】成功构建了Hac1i基因随机插入和Hac1u基因原位插入菌株。     

农杆菌介导苹果炭疽病菌的遗传转化及转化子鉴定

【目的】优化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的技术体系,并对转化子进行筛选鉴定,比较其生物学特性和致病性差异。【方法】以苹果炭疽病菌LXS010101分生孢子为转化受体,利用携带重组双元载体的农杆菌进行转化;对获得的转化子进行遗传稳定性测定、PCR检测及Southern blot分析;选取一定数量的转化子,比较其菌落形态、生长速率及分生孢子发育等主要生物学性状及致病性的差异。【结果】苹果炭疽病菌的最优转化体系为：病菌分生孢子悬浮液浓度1×105个/mL,共培养温度和时间分别为22℃和24 h,共培养基中添加200 μmol•mL-1乙酰丁香酮,其转化效率达到1×105个孢子可获得439个转化子。随机选取30个转化子进行鉴定,发现T-DNA已整合进炭疽病菌基因组中,在所检测的转化子中都是以单拷贝的形式整合,且能够稳定遗传。与野生型菌株相比,转化子的菌落形态没有发生明显变化,但23.33%的菌株生长速率显著减低;转化子ATJ-3和ATJ-15不能产生分生孢子,在28个产孢菌株中,分生孢子萌发率显著减低的菌株占39.29%,附着胞形成比例显著减低和形态异常的菌株占25.00%。致病性测定结果显示,11个转化子的致病力显著降低,其中菌株ATJ-19完全丧失致病能力。【结论】优化的苹果炭疽病菌遗传转化技术体系,可用于炭疽病菌致病相关基因的克隆及致病分子机理的研究。     

Development of Highly Efficient Transformation System of Yeast-Like Conidia of Tremella fuciformis

Tremellafuciformis is one of higher basidiomycetes. Its basidiospore can reproduce yeast-like conidia, which is also called the blastospore by budding. The yeast-like conidia of T. fuciformis is monokaryotic and easy to culture by submerged fermentation similar to yeast. Thus, it is a good recipient cell for exogenous gene expression. In this study, the expression plasmid pAN7-1 （containing promoter gpd-An derived from Aspergillus nidulans and selectable marker gene hph conferring resistance to hygromycin B） and plasmid pLg-hph （containing promoter gpd-Le derived from Lentinula edodes and selectable marker gene hph） were transformed into the yeast-like conidia of T. fuciformis by PEG-mediated protoplast transformation, respectively. The primary putative transformants were selected by the sandwich screening method with the selective medium containing 50 μg mL^-1 hygromycin. The putative transformants were obtained from the primary putative transformants transferred on PDSA plates containing 100 μg mL^-1 hygromycin for second round selection. Experimental results showed that the optimal concentration of PEG 4000 for mediating protoplast transformation was 25%. PCR and Southern blotting confirmed that the selectable marker gene hph was integrated effectively into the genome of the yeast-like conidia of T. fuciformis with plasmid pLg-hph transformation. Its transformation efficiency was 110 transformants per μg DNA, and the hph gene was integrated into the genome of some yeast-like conidia with plasmid pAN7-1 transformation. However, its transformation efficiency was only 9 transformants per μg DNA. The presence of hph gene in the genome of transformants after 5 generations of sub- culturing on PDSB medium was confirmed by PCR, suggesting that the foreign gene hph was stable during subculture.     

十种柚类及柚杂种果实中类黄酮含量的超高效液相色谱分析

【目的】利用超高效液相色谱法同时检测10种柚及柚杂种果实中11种类黄酮含量,测定分析各品种果实类黄酮的种类及其含量变化规律。【方法】超高效液相色谱法,色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 分析柱（2.1 mm×100 mm,1.7 μm）;流动相：0.1%乙酸水溶液（A）和甲醇（B）,采用梯度洗脱,洗脱程序为：（1） 0—5 min,90%—80% A;（2）5—10 min,80%—30% A;（3）10—15 min,30%—20% A;（4）15—16 min,20%—90% A;柱温：35℃;流速：0.3 mL•min-1。【结果】类黄酮组分及含量与柑橘的遗传基因型有关,柚果实中类黄酮以柚皮苷为主,葡萄柚果实中以柚皮苷和新橙皮苷为主。柚皮苷在瑞红中含量最高（果皮：27.5 mg•g-1 DW,果肉：2.73 mg•g-1 DW）,新橙皮苷在鸡尾中含量最高（果皮：14.93 mg•g-1 DW,果肉：0.70 mg•g-1 DW）。杂种后代类黄酮累积受其亲本影响。【结论】超高效液相色谱法是一种定性定量柑橘果实类黄酮的有效方法,柚果实中类黄酮含量丰富且各种类之间组分含量差异显著。     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的拟轮枝镰孢ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠（cefotaxime sodium,Cefo）和氨苄青霉素钠（ampicillin sodium,Amp）对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B（hygromycin B）的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因（GFP）、潮霉素抗性基因（HPH）的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150 μg·mL ^-1时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150 μg·mL ^-1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP（登录号：LC420351.1）的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。 【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

绿盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1基因原核表达、 纯化与酶学特性

【目的】在前期克隆了绿盲蝽水溶性海藻糖酶（ALTre-1）基因的基础上,以获得具有酶活性的重组蛋白,明确酶促反应的最佳pH值及最适温度,为绿盲蝽海藻糖酶分子调控机制及其抑制剂的应用研究奠定基础。【方法】将含有绿盲蝽ALTre-1基因的T载体经Nde I和Not I双酶切,构建ALTre-1基因原核表达载体（pET28a-ALTre-1）,表达载体经诱导表达和蛋白纯化,获得ALTre-1功能区纯化蛋白。在蛋白浓度为0.3 mg•mL-1的条件下,以海藻糖为底物,对纯化得到的重组Tre-1蛋白进行活性检测,确定其酶促反应的最佳pH值和最佳温度。【结果】ALTre-1基因在大肠杆菌中BL21中能够高效表达,纯化获得的重组蛋白在试验条件下有较高的海藻糖酶水解活性（（184.83±13.39）nmol•μg-1•min-1）。重组ALTre-1蛋白活性最适pH值为7.0（酶活性为（202.04±13.76）nmol•μg-1•min-1）,表明重组ALTre-1蛋白是1个在中性环境中具有最佳活性的海藻糖酶,同时重组ALTre-1蛋白酶活性最适温度为55℃（酶活性为（228.59±4.62）nmol•μg-1•min-1）。【结论】本研究克隆得到了ALTre-1全长基因,获得了具有海藻糖酶活的重组蛋白,该重组蛋白在pH 7.0、温度55℃条件下酶活性最高。     

精子与慢病毒共孵育条件的优化以及转基因猪的制备

【目的】探索慢病毒与精子共孵育的方法,并制备转基因猪。【方法】采用正交试验分析精子密度、病毒量、精子与慢病毒共孵育时间、精子与慢病毒共孵育温度对精子活力的影响,采用PCR和Southern blotting检测转基因。【结果】①优化慢病毒与精子共孵育条件为：100 µL慢病毒原液（5×105cfu）与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min;②与病毒孵育后的精子（109个/mL）给母猪人工授精时,经PCR检测49头仔猪中有14头呈阳性;③Southern blotting结果表明,8头PCR阳性仔猪中,4头融合了外源基因。【结论】优化了精子与慢病毒共孵育的条件（100 µL慢病毒原液（5×105cfu）与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min）,成功制备了转基因猪,并检测有外源基因的融合。