小菜蛾中肠氨肽酶N2在昆虫细胞中的表达

利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac baculovirus expression system)表达获得小菜蛾 Plutella xylostella(L.)中肠氨肽酶N2(aminopeptidase N,APN2)蛋白,成功建立了该蛋白在昆虫细胞中的表达体系。将对Cry1Ac毒素敏感和已产生抗性的小菜蛾中肠APN2基因插入表达载体pFAST Bac HTB中,并在草地夜蛾 Spodoptera frugiperda 细胞系(Sf9)中进行了重组表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白免疫印迹技术(Western-blotting)结果显示,在107 kDa处有1条特异性蛋白条带。研究表明,小菜蛾中肠APN2基因可在Sf9细胞中成功表达,这为继续研究其功能及抗性的关系奠定了基础。     

几种植物源活性物质对昆虫细胞的毒力测定

本文测定几种植物源活性物质对甜菜夜蛾离体培养细胞系IOZCAS-Spex-II和草地贪夜蛾离体培养细胞系Sf 9细胞增殖活性的抑制作用.试验结果表明,喜树碱、羟基喜树碱和鱼藤酮对两种昆虫细胞具有较好的抑制作用.在测定的时间(2、6、12、24、48、72 h)和剂量(1.0×10-3、1.0×10-2、1.0×10-1、1.0×100,1.0×101、1.0×102μmol/L)范围内,喜树碱、羟基喜树碱和鱼藤酮对甜菜夜蛾IOZCAS-Spex-II和草地贪夜蛾Sf 9的细胞毒性具有较好的时间和剂量依赖性,而印楝素、乌头碱、次乌头碱、伪石榴皮碱、马钱子碱和吴茱萸碱对其细胞毒性具有一定的时间效应,无明显的剂量关系.     

高效氯氰菊酯对草地贪夜蛾Sf9细胞自噬的诱导作用

采用噻唑蓝（MTT）染色、显微镜及透射电子显微镜观察、单丹磺酰戊二胺（MDC）荧光染色及蛋白质免疫印迹（WB）技术等方法,分别针对高效氯氰菊酯（beta-cypermethrin）作用后草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢细胞系Sf9细胞的细胞活力、自噬发生的典型特征及自噬相关蛋白变化情况进行了测试及分析。结果表明:经不同浓度高效氯氰菊酯处理后,对草地贪夜蛾Sf9细胞活性的抑制效应与作用剂量及时间呈现依赖关系,并表现出典型的细胞自噬现象;LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平比和Beclin 1蛋白表达量呈现上调趋势,分别为对照组的201.32%和136.00%,p62蛋白表达量下调至对照组的68.13%。研究表明,高效氯氰菊酯对草地贪夜蛾Sf9细胞具有显著的细胞毒性,并且其对细胞活力的抑制作用与自噬诱导途径相关。     

GFP与水稻条纹病毒病害特异蛋白的融合基因在sf9昆虫细胞中的表达

 用重叠延伸PCR(overlap Polymerase Chain Reaction,overlap-PCR)方法获得了含有绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)和水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)病害特异性蛋白SP(Disease-specific protein)两者的融合基因(GFP-SP),并将其克隆至载体pMD18-T,得到的重组质粒pMD18-T-GFP-SP经Xba Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切后与经相同方法处理过的杆状病毒转移载体pFastBacHTb相连接构建成重组转移质粒pFastBacHTb-GFP-SP。酶切和测序鉴定证明了其序列的正确性并且无移码现象发生。将此质粒转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,得到含有目的基因片段的重组杆状病毒穿梭质粒rb-GFP-SP。以之转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda,sf9)细胞,24~48h后在显微镜200倍可见光视野下观察到被感染细胞发生了细胞和细胞核变大、细胞内颗粒物增多、细胞脱落甚至裂解等一系列与正常的st9昆虫细胞形态有明显区别的变化。荧光显微镜下可见部分细胞发出清晰的绿色荧光,且大部分荧光集中在细胞质部分。这些结果表明,GFP-SP融合蛋白在st9昆虫细胞内成功表达。     

重组病毒AcMNPV-BmK IT侵染Sf9细胞后凋亡相关基因的表达分析

将从东亚钳蝎中克隆到的兴奋型昆虫毒素基因(BmK IT)同源重组到苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组中,得到重组病毒AcMNPV-BmK IT,抗虫试验表明重组杆状病毒的杀虫活性明显优于野生型病毒,但AcMNPV介导的BmK IT的抗虫分子机制尚未阐明。本试验从草地贪夜蛾Sf9细胞中克隆获得了凋亡相关基因Sfp53,制备了抗体,分析了AcMNPV-BmK IT对Sfp53表达的影响,结果表明被重组病毒感染的细胞所表达的Sfp53时间与表达量与野生型相比都有所提前和提高,说明重组病毒可加速细胞的凋亡;同时通过半定量PCR分析了AcMNPV-BmK IT感染Sf9细胞时病毒抗凋亡基因iap2的表达,结果表明重组型病毒抗凋亡基因iap2表达量减少。以上结果在细胞分子水平上解释了AcMNPV-BmK IT杀虫活性提高的原因。     

2株感染蠼螋的球孢白僵菌的分离鉴定及对草地贪夜蛾的毒力

对采自玉米田自然罹病蠼螋成虫上的病原菌进行分离培养,结合形态学和rDNA-ITS序列分析,对分离纯化获得的2株病原菌进行生物学特性测定及种类鉴定,并采用浸渍法测定了2株病原菌对草地贪夜蛾3龄幼虫的毒力。结果表明,从自然罹病的2头蠼螋分离获得的病原菌均为球孢白僵菌Beauveria bassiana,编号为YY-1和HNC-1。在25℃下,YY-1和HNC-1菌株在SDAY培养基上菌落直径日增长速率分别为(3.06±0.20)mm/d和(4.57±0.23)mm/d,培养第15天时产孢量分别为(5.20±1.06)×10~7个/cm~2和(1.83±0.47)×10~8个/cm~2。球孢白僵菌YY-1和HNC-1对草地贪夜蛾3龄幼虫均具有致病力,其中在1.0×10~8个/mL浓度下第8天草地贪夜蛾3龄幼虫累计校正死亡率分别达到83.3%和63.3%,对草地贪夜蛾3龄幼虫的LC₅₀为1.56×10~5个/mL和2.11×10~5个/mL,LT₅₀分别为4.23 d和6.12 d。综合以上结果,2株球孢白僵菌对草地贪夜蛾幼虫具有较强的毒力,其中YY...     

草地贪夜蛾莱氏绿僵菌的分离鉴定

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)是2019年入侵我国的一种迁飞性害虫,已成为严重影响我国玉米生产的重要害虫。目前国内关于草地贪夜蛾昆虫病原真菌的研究报道很少。2019年6月,在云南省曲靖市沾益县安东村玉米田调查发现了被虫生真菌感染的草地贪夜蛾幼虫。经室内分离培养,结合形态和ITS序列相似性分析鉴定确认,感染草地贪夜蛾幼虫病原性真菌为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi,编号为ZYSP190701菌株。调查表明,2019年7月17日田间草地贪夜蛾的莱氏绿僵菌感染率为15.46%±2.52%,8月2日感染率达29.83%±13.71%。用莱氏绿僵菌ZYSP190701菌株1×10~8个/mL孢子浓度接种草地贪夜蛾3龄幼虫后第7天时草地贪夜蛾的感染死亡率高达100%。上述结果表明,莱氏绿僵菌ZYSP190701对草地贪夜蛾有良好的生防潜力,具有草地贪夜蛾生防菌剂开发应用的前景。     

小麦与白粉病菌互作中β-1,3-葡聚糖的细胞定位

 利用免疫胶体金方法对小麦与白粉病菌互作过程中β-1,3-葡聚糖酶底物,即β-1,3-葡聚糖的合成与分布情况进行了研究。结果发现,白粉病菌的所有器官包括分生孢子、附着胞、入侵栓、吸器和菌丝中均未发现β-1,3-葡聚糖存在;相反,β-1,3-葡聚糖是小麦各种细胞壁的正常组分,在气孔保卫细胞、纤维细胞、导管分子等的细胞壁中含量非常丰富。病原菌的侵染导致植物细胞中β-1,3-葡聚糖的合成增加,但在乳突结构中不含β-1,3-葡聚糖。以上结果说明,往小麦中导入外源β-1,3-葡聚糖酶基因并高效表达,不会对病原菌结构产生直接的破坏和抑制作用;相反,有时可能会影响到某些植物细胞的正常发育。     

草地贪夜蛾取食诱导玉米叶片转录组分析

为阐明玉米响应草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda取食胁迫防御反应的分子机制,利用RNAseq技术对草地贪夜蛾取食的玉米叶片进行转录组测序分析,并对抗虫代谢产物生物合成途径中的基因进行筛选鉴定。结果显示,与未接虫对照相比,草地贪夜蛾取食18 h导致玉米叶片中有1 645个基因差异表达(log2|处理/对照|1且FDR0.05),其中上调表达基因有1 352个,下调表达基因有293个。茉莉酸、水杨酸、乙烯等植物激素生物合成与信号转导途径相关基因大多上调表达,其中44个茉莉酸途径相关基因全部上调表达,说明该途径在玉米响应草地贪夜蛾取食诱导的防御反应中发挥着核心作用,其它激素生物合成与信号转导途径发挥协同作用。玉米重要抗虫次生代谢物苯并噁唑嗪酮类生物合成相关基因中有9个基因上调表达;15个萜烯挥发物生物合成相关差异表达基因中有14个上调表达,包括8个萜烯合成酶基因和1个CYP基因CYP92C5。表明草地贪夜蛾取食会诱导玉米复杂的植物激素途径和基因调控机制,激活以次级抗虫代谢物合成为主的防御反应。     

新型2,6-二氟苯甲酰脲类化合物对草地贪夜蛾的生物活性及其几丁质合成的影响

本文通过对已报道的具有优异杀虫活性的肟醚苯甲酰脲类化合物NK-17进行结构改造，得到化合物(E)-N-((4-((叔丁氧亚氨基)甲基)苯基)甲氨基甲酰基)-2,6-二氟苯甲酰胺(以下简称为“HN-21”)，以改善其在有机溶剂中的溶解能力。采用叶片药膜法测定HN-21和对照药剂虱螨脲对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda 2龄幼虫的生物活性，并分析其对草地贪夜蛾几丁质合成过程的影响。结果表明，HN-21对草地贪夜蛾幼虫72 h的致死中浓度为0.681 mg/L，显著低于虱螨脲(10.052 mg/L)，受试昆虫均死于蜕皮过程中。受试昆虫用虱螨脲10.052 mg/L处理24 h时，几丁质合成通路基因(sfTRE1、sfTRE2、sfGFAT、sfUAP、sfCHS1)表达量明显下降，早于用HN-21 0.681 mg/L处理组，但48 h时两组昆虫基因表达量下调程度已无显著性差异。该研究结果可为更好地开发利用苯甲酰脲类化合物提供理论依据。     

不同温度下草地贪夜蛾年龄-阶段实验种群两性生命表的构建

为明确不同温度对草地贪夜蛾种群动态的影响,建立草地贪夜蛾种群动态模型,本研究通过建立年龄-阶段两性种群生命表得到了室内不同温度下草地贪夜蛾种群的生命表参数,并以此为基础预测了未来2个月内草地贪夜蛾的种群动态。结果表明:不同温度(20、24、28、32、36℃)条件下草地贪夜蛾各阶段发育历期、存活率及繁殖力有显著差异。草地贪夜蛾的世代周期随温度降低而显著延长。20℃条件下世代周期最长,为(75.25±1.23)d;36℃条件下最短,为(24.79±0.36)d。草地贪夜蛾从卵存活到成虫的概率32℃下最高,为80%;20℃下最低,仅为24%。24℃条件下单雌平均产卵量为(1 448.83±97.64)粒,显著高于其他温度条件下。24℃条件下,种群净增长率(R_0)最高,为420.16±71.48。内禀增长率(r)随温度升高先升高后降低,在28℃时达到最高值。根据种群生命表参数预测未来60 d内种群动态结果表明,较高温度有利于草地贪夜蛾种群世代数的增加,适当低温下产卵量大,更有利于种群数量的增加。本研究结果表明草地贪夜蛾有较广的适宜生存的温度范围,在20～36℃温度范围内均能完成生长发育和生殖。24～32℃是幼虫的最适生长发育温度范围,24℃是成虫最适的繁殖温度。     

昆虫病原线虫对草地贪夜蛾生理生化和组织病理学的影响

为明确昆虫病原线虫侵染对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda生理生化和组织病理学的影响,选择草地贪夜蛾6龄幼虫分别注入樱桃异小杆线虫Heterorhabditis beicherriana和小卷蛾斯式线虫Steinernema carpocapsae,测定草地贪夜蛾幼虫体内抗氧化酶和解毒酶活性以及能源物质含量的变化,并于显微镜下观察线虫侵染后草地贪夜蛾幼虫中肠和脂肪体组织的病理变化。结果显示,供试 2 种线虫对草地贪夜蛾6龄幼虫均有致死作用,注射剂量为2~3条侵染期线虫（infective juve-niles,IJs）/μL 的樱桃异小杆线虫和小卷蛾斯式线虫 24 h 后,草地贪夜蛾幼虫的死亡率分别为16.67%和96.67%。注射2~3 IJs/μL线虫后,草地贪夜蛾幼虫体内超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽S-转移酶和羧酸酯酶的活性基本呈先上升后下降的变化趋势,注射樱桃异小杆线虫和小卷蛾斯式线虫后各酶活性达到峰值的时间分别为注射后24 h和12 h;血浆中总蛋白含量呈波动变化,海藻糖和游离脂肪酸的含量均逐渐降低。注射线虫后草地贪夜蛾6龄幼虫的中肠和脂肪体结构均被破坏,且小卷蛾斯式线虫引起的病变更快也更严重。表明相较于樱桃异小杆线虫,小卷蛾斯式线虫对草地贪夜蛾的生防潜能更大。     

基于转录组测序解析草地贪夜蛾对溴氰虫酰胺的解毒代谢分子机制

为阐明草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda对溴氰虫酰胺的解毒代谢分子机制,通过LC₅₀的溴氰虫酰胺诱导草地贪夜蛾3龄幼虫后,利用酶活测定和转录组测序鉴定解毒代谢相关基因,并采用实时荧光定量PCR技术对细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase,P450)基因进行验证分析。结果表明,经LC₅₀的溴氰虫酰胺处理后,草地贪夜蛾3龄幼虫体内3种解毒代谢酶活性较对照均有所升高,但仅P450活性较对照显著升高,而谷胱甘肽S-转移酶和羧酸酯酶与对照无显著差异。经LC₅₀的溴氰虫酰胺处理后草地贪夜蛾3龄幼虫转录组中共筛选到1 408个差异表达基因,其中上调表达的基因有935个,下调表达的基因有473个。药物代谢-细胞色素P450通路、药物代谢-其他酶通路及细胞色素P450对异生物质的代谢通路中有超过20个基因存在差异表达。在草地贪夜蛾转录组中筛选鉴定到121个P450基因,其中,属于CYP2、CYP3、CYP4以及Mito家簇的基因分别有9、45、58和9个,而经LC_5...     

小菜蛾CYP6BG1基因体外真核表达及其对氯虫苯甲酰胺的代谢

小菜蛾Plutella xylostella是为害十字花科作物的世界性重要害虫,对氯虫苯甲酰胺产生了严重抗性。已经明确小菜蛾CYP6BG1的过量表达与其对氯虫苯甲酰胺的抗性相关。本文进一步通过昆虫杆状病毒表达系统在Sf9细胞中表达了小菜蛾CYP6BG1和NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)蛋白,并检测Sf9细胞表达CYP6BG1蛋白后对氯虫苯甲酰胺的敏感变化及氯虫苯甲酰胺经CYP6BG1蛋白代谢后对小菜蛾幼虫毒力的变化。结果显示:Sf9细胞中与CPR共表达的CYP6BG1具有7-乙氧基香豆素O-脱乙基酶活性,且细胞对氯虫苯甲酰胺的敏感性显著下降。将表达的蛋白与不同浓度的氯虫苯甲酰胺孵育24 h后,对3龄小菜蛾幼虫致死率显著低于对照组。本研究结果间接表明CYP6BG1能够降解氯虫苯甲酰胺,从而增强小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性。     

抗对硫磷单链抗体在昆虫细胞中的表达及活性鉴定

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,在Sf9昆虫细胞中表达抗对硫磷单链抗体,并评价该重组抗体scFv-4C6的分子识别活性。以分泌能特异性识别对硫磷的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C6为RNA来源,采用RT-PCR方法扩增抗体的重链和轻链可变区基因,经重叠延伸PCR方法串联拼接获得单链抗体基因片段(scFv-4C6)。构建包含目的片段的重组杆粒Bacmid-scFv-4C6,转染Sf9细胞表达目的蛋白,采用免疫印迹法(Western blotting)检测表达产物,间接竞争酶联免疫吸附(ic-ELISA)法评价产物的生物活性。结果表明:scFv-4C6基因片段拼装正确,成功转染Sf9细胞,并在转染后72 h表达量最高,表达的单链抗体大小为28.3 kD;表达产物能特异性识别对硫磷,IC50值为7.9 ng/mL,对甲基对硫磷和杀螟硫磷分别有12%和1.8%的交叉反应率,与亲本单克隆抗体的识别性能相似。该研究表明,具有生物活性的抗对硫磷单链抗体scFv-4C6可在昆虫细胞中成功得到表达。     

大豆疫霉菌对大豆下胚轴侵染过程的细胞学研究

 接种后1.5~24h,用光镜和电镜研究了2个大豆品种与大豆疫霉菌Ps411的亲和性和非亲和性互作。观察结果表明,大豆疫霉菌对大豆下胚轴的侵染过程可分为侵入前、侵入、皮层组织中的扩展和进入维管束组织4个连续阶段。大豆下胚轴接种后在25℃保湿培养,1.5h后游动孢子即形成休止孢并萌发产生附着孢,3h后侵入表皮细胞,6h后进入皮层组织,24h后进入维管束组织。病原菌主要以侵染菌丝直接侵入表皮,表皮细胞间隙是主要侵入部位。皮层细胞是病原菌定殖和发展的主要场所,胞间菌丝侵入皮层细胞并形成吸器。在菌丝与寄主细胞接触部位的寄主细胞壁与质膜之间常有胞壁沉积物的形成。在抗病品种上病菌的侵染事件与感病品种基本一致,但不能形成正常的吸器,胞壁沉积物明显多于感病品种,菌丝在寄主组织内的扩展明显受到抑制。利用β-1,3-葡聚糖免疫金标记单克隆抗体进行的免疫细胞化学的研究表明,胞壁沉积物内含有大量的β-1,3-葡聚糖,在大豆疫霉菌菌丝壁中也存在β-1,3-葡聚糖。以上结果表明,病原菌的侵染可诱导抗病寄主细胞内β-1,3-葡聚糖迅速的合成与积累、并形成胞壁沉积物,以抵御病菌的侵染与扩展。     

通过染色体整合β-1,4-葡聚糖酶基因glu14提高绿色木霉对小麦纹枯病的防治效果

 绿色木霉LTR-2是生物防治菌株。利用来自巨大芽胞杆菌Ap25的β-1,4-葡聚糖酶基因glu14构建木霉表达载体pSilent/glu14,利用限制性内切酶介导法(REMI)转化绿色木霉LTR-2。PCR扩增及Southern杂交证实目的基因已插入木霉转化子的染色体DNA上。转化子的β-1,4-葡聚糖酶水解活性,对小麦纹枯病菌的平板抑制作用及温室防治效果较原始菌株LTR-2明显提高(P<0.01),其中转化子L-10的效果最好,平板抑制率比LTR-2提高了27.0%,温室防治效果比LTR-2提高了26.7%。本试验表明,利用REMI技术,将β-1,4-葡聚糖酶基因重组到木霉染色体DNA上,是获得高效木霉工程菌株的有效手段。